土壤微生物碳的測定--儀器分析法

1、儀器與試劑：

自動有機(jī)碳分析儀、真空干燥器、小燒杯（蒸發(fā)皿）、塑料瓶、中速定量濾紙、漏斗、震蕩儀、電子稱等

（1）無乙醇氯仿：氯仿中含有少量乙醇做穩(wěn)定劑，乙醇會影響氯仿在低壓下沸騰。所以需要提純。

提純：在通風(fēng)櫥中，將氯仿（三氯甲烷）按1:2的體積比與蒸餾水一起加入分液漏斗中，充分搖動1min，慢慢放出下層氯仿于燒杯中，如此重復(fù)洗滌三次。得到無乙醇氯仿，加入適量無水氯化鈣，去除氯仿中的水分?？芍貜?fù)使用。

（2）?0.5mol/L硫酸鉀溶液：稱取硫酸鉀87.1g，溶于去離子水中，稀釋至1000ml

（3）? 1mol/L NaoH溶液：稱取氫氧化鈉（AR）4g，置于一大燒杯中，并立即倒出，然后加入不含二氧化碳的蒸餾水約100mL，將溶液注入細(xì)口瓶中，塞緊橡皮塞，混勻，備用。?

2、操作步驟：

（1）培養(yǎng)

①稱取過2mm篩的新鮮土樣（相當(dāng)于干土10g，取部分樣測含水量，確定稱取土樣重量）2份，分別放入25ml小燒杯（培養(yǎng)皿）中。將盛有一份土樣的燒杯放入真空干燥器中，并放置盛有無乙醇氯仿（約放置燒杯2/3的量）的25ml燒杯，燒杯內(nèi)放入少量防爆沸玻璃珠，同時(shí)放入盛有1mol/L NaOH溶液的小燒杯（吸收熏蒸過程中釋放出來的CO2）。

②蓋上真空干燥器蓋子，用真空泵抽真空，使氯仿保持沸騰5min。關(guān)閉真空干燥閥門，于25度黑暗條件下培養(yǎng)24h。另一份樣置于另一干燥器中為不熏蒸對照處理。

③熏蒸結(jié)束后，打開真空干燥器閥門（應(yīng)該聽到空氣進(jìn)入的聲音，否則熏蒸不完全，重做，取出盛有氯仿（可重復(fù)利用）和稀NaOH溶液的小燒杯，清潔干燥器，反復(fù)抽真空（5到6次，每次30分鐘，每次抽真空后最好完全打開干燥器蓋子），直到土壤無氯仿味道為止。

④從干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土樣，將土樣轉(zhuǎn)移到80ml聚乙烯離心管（塑料瓶）中，加入40ml 0.5mol/L 硫酸鉀溶液（土水比1：4）800 r/min振蕩30分鐘，用中速定量濾紙過濾。同時(shí)做一個無土壤機(jī)制空白。土壤提取液最好立刻分析，或--20℃冷凍保存，使用前需解凍搖勻。

儀器測定法：

吸取上述土壤提取液10ul注入自動總有機(jī)碳（TOC）分析儀上，測定提取液有機(jī)碳含量。（儀器使用方法待定）

3、結(jié)果計(jì)算：?

土壤微生物生物量碳：Bc=Ec/Kec

Ec為熏蒸與未熏蒸土壤的差值；

Kec為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值為0.45

土壤微生物氮--氯仿熏蒸-TOC

1. 微生物氮測定

1.1、實(shí)驗(yàn)試劑

所有試劑除注明者外，均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水或去離子水或相當(dāng)濃度的水。

（1）無乙醇氯仿：氯仿中含有少量乙醇做穩(wěn)定劑，乙醇會影響氯仿在低壓下沸騰。所以需要提純。

提純：在通風(fēng)櫥中，將氯仿（三氯甲烷）按1:2的體積比與蒸餾水一起加入分液漏斗中，充分搖動1min，慢慢放出下層氯仿于燒杯中，如此重復(fù)洗滌三次。得到無乙醇氯仿，加入適量無水氯化鈣，去除氯仿中的水分。可重復(fù)使用。

（2）硫酸鉀提取劑；

（3）硫酸鉻鉀還原劑；

（4）硫酸銅溶液；

（5）10 mol L-1氫氧化鈉溶液；

（6）4 mol L-1氫氧化鈉溶液；

（7）0.01 mol L-1氫氧化鈉溶液；

（8）硼酸溶液；

（9）標(biāo)準(zhǔn)硼砂溶液；

（10）指示劑貯存液；

（11）指示劑溶液；

（12）標(biāo)準(zhǔn)氯化銨貯存液；

（13）標(biāo)準(zhǔn)氯化銨溶液。

1.2、實(shí)驗(yàn)儀器

流動注射氮分析儀、真空抽濾瓶、容量瓶、其他儀器設(shè)備同土壤微生物碳。

1.3、實(shí)驗(yàn)步驟

（1）土壤前處理、熏蒸、提取同微生物碳處理。

（2）提取液中硝態(tài)氮還原：吸取15.0 ml熏蒸與不熏蒸土壤0.5 mol L-1 K2SO4浸提液于250 ml消化管中，加入10 ml硫酸鉻鉀還原劑和300 mg鋅粉，至少放置2 h后再消化。研究結(jié)果表明熏蒸與不熏蒸土壤提取液中硝態(tài)氮含量差異很小，在測定土壤MB-N時(shí)，可以不包括硝態(tài)氮，即省略提取液中硝態(tài)氮還原過程。

（3）消化：方法Ⅰ：吸取10.0 ml熏蒸與不熏蒸土壤0.5 mol L-1 ?K2SO4浸提液（或經(jīng)還原反應(yīng)后的浸提液）于250 ml消化管中，加入0.2 ml 0.19 mol L-1 CuSO4溶液、5 ml分析純濃硫酸、及少量防瀑沸的顆粒物（如經(jīng)濃硫酸處理并洗滌后烘干的瓷片，0.5 cm大?。?，混合液消化變清后再回流3 h。

（4）消化液中氮測定：消化液冷卻后，用去離子水洗滌轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中，至體積大約為70 ml，待再冷卻后慢慢加入10 ml 10 mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4，邊加邊充分混勻（以免因局部堿濃度過高而引起消化液中NH4+的損失），再用去離子水定容至100 ml。溶液中NH4+含量采用流動注射氮分析儀（FIAStar 5000型）測定。采用40 μl樣品圈，KTN擴(kuò)散膜（耐強(qiáng)酸和強(qiáng)堿），載液為去離子水，試劑Ⅰ為4 mol L-1 NaOH溶液，試劑Ⅱ?yàn)橹甘緞┤芤骸?/p>

（5）校正曲線溶液制備：分別取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 50?μg N ml-1標(biāo)準(zhǔn)氯化銨溶液于100 ml容量瓶中，分別用去離子水洗滌轉(zhuǎn)移1個空白消化液于容量瓶中，其余操作步驟同樣品，用去離子水定容至100 ml，即得濃度分別為0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg N ml-1系列標(biāo)準(zhǔn)氯化銨溶液，采用測定KTN方法模塊測定和制備工作曲線，校正曲線溶液最少應(yīng)每個月制備一次。其他具體操作參見儀器使用說明。

1.4、計(jì)算：

土壤MB-N?= EN/KEN

式中：EN =?熏蒸土壤提取的全氮?– 不熏蒸土壤提取的全氮；

kEN為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值0.25。

土壤微生物磷的測定--無機(jī)磷測定法

1、儀器與試劑：分光光度計(jì)，培養(yǎng)皿、真空干燥器、25ml、1000ml容量瓶、塑料瓶。

（1）無乙醇氯仿

（2）0.5mol/L NaHCO3 浸提液：溶解 NaHCO3 42.0g于800mL水中，以0.5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)浸提液的PH至8.5，再用去離子水稀釋至1000mL。（此溶液爆于空氣中可因失去CO2而使PH增高，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用）

（3）250mg/L磷酸二氫鉀溶液：稱取1.0984g分析純磷酸二氫鉀（稱量前105℃烘2-3小時(shí)），溶于去離子水并定容至1000mL .

（4）鉬銻抗試劑：

?5g /L酒石酸氧銻鉀溶液：稱取鉬酸銨0.5g，溶于100mL水中

?鉬酸銨-硫酸溶液：稱取鉬酸銨10g，溶于450mL水中，緩慢地加入153mL濃H2SO4，邊加邊攪拌。

再將上述?溶液加入到?溶液中，最后加水至1000mL 。充分搖勻，儲存于棕色瓶中，此為鉬銻抗混合液。

臨用前（當(dāng)天），稱取左旋抗壞血酸1.5g，溶于100mL 鉬銻抗混合液中，混勻，此即鉬銻抗試劑。有效期24h。

（5）磷標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取在105℃烘箱中的KH2PO4（分析純）0.2195g，溶解在400mL水中，加濃H2SO4 5mL（加H2SO4防長霉菌，可使溶液長期保存），轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液為50ug/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取上述磷標(biāo)準(zhǔn)溶液25mL，用去離子稀釋定容至250mL，即得5ug/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（此溶液不宜久存）。

（6）0.5mol/L NaOH溶液：稱取氫氧化鈉（AR）2g，置于一大燒杯中，并立即倒出，然后加入不含二氧化碳的蒸餾水約100mL，將溶液注入細(xì)口瓶中，塞緊橡皮塞，混勻，備用。

2、操作步驟：

（1）稱取過稱取過2mm篩的新鮮土樣（相當(dāng)于干土5g）3份，分別放入3個25ml小燒杯中。一份熏蒸，兩份不熏蒸。熏蒸處理同測定微生物碳。

（2）從干燥器中取出熏蒸和未熏蒸一份土樣，將土樣轉(zhuǎn)移到250毫升聚乙烯提取瓶（塑料瓶）中，加入100ml 0.5mol/L NaHCO3 浸提液（水土比20:1）,300r/min振蕩30min ,用慢速定量濾紙過濾。同時(shí)做一個無土壤機(jī)制空白。土壤提取液最好立刻分析，或-20℃冷凍保存，使用前需解凍搖勻。

（3）另一份未熏蒸土樣放入250毫升聚乙烯提取瓶（塑料瓶），加入0.5ml 250mg/L磷酸二氫鉀溶液，再加入100mL 0.5mol/L NaHCO3 浸提液，同上進(jìn)行提取。（用來測定外加正磷酸鹽態(tài)無機(jī)磷的回收率Rpi，以校正土壤對熏蒸處理所釋放出來的微生物生物量磷的吸附與固定。）

（4）吸取上述3種提取液10ml（依樣品含磷量而定）于25ml容量瓶中，吸取外加磷的提取液5ml。加入適量的1.0mol/L HCL溶液進(jìn)行中和，HCL溶液的加入量通常為提取液體積的一半。（即加入5ml,外加磷的提取液加入2.5ml）,放置4小時(shí)并間隙振蕩（以排除溶液中的CO２）補(bǔ)充去離子水至20mL（看情況添加），加入4mL混合顯色劑，再加水定容，搖勻。顯色完全（約30min）后，在880nm波長處進(jìn)行比色。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取5ug/mL，磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1、2、3、4、5mL分別放入25ml容量瓶中，加水約至20ml，然后加鉬銻抗試劑4ml,最后用水定容至25mL。30min后開始進(jìn)行比色。

4、結(jié)果計(jì)算：土壤微生物生物量磷（Bp）：Bp=Epi/(Kp*Rpi)

式中：

Epi為熏蒸和未熏蒸土壤的差值；

Rpi為（外加磷酸二氫鉀溶液土壤的測定值-未熏蒸土壤的測定值）/25*100%；

Kp為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值為0.4。