赤霉素(Gibberellins,GAs)作為植物體內(nèi)廣泛存在的一類生長調(diào)節(jié)劑，是高等植物體內(nèi)的一類四環(huán)二萜羧酸化合物,參與調(diào)控植物種子萌發(fā),下胚軸伸長,葉片伸展,花、果實(shí)及種子發(fā)育等諸多生理過程。截至1976 年就從植物中分離鑒定出32種赤霉素，至今,發(fā)現(xiàn)的赤霉素的種類己有百種之多。
研究表明,赤霉素在植物抵抗非生物脅迫中也發(fā)揮著重要作用,主要通過調(diào)節(jié)GAs的生物合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其生物活性,以提高植物對非生物脅迫的耐受性。
一、實(shí)驗方法及原理
本次實(shí)驗通過提取樣品中植物內(nèi)源激素，再以安捷倫1290高效液相色譜儀串聯(lián)AB公司Qtrap6500質(zhì)譜儀，測定植物內(nèi)源激素。
1.試劑
以下所有試劑如無特別注明，均為分析純。實(shí)驗用水為蒸餾水，去離子水或相當(dāng)純度的水。
赤霉素(GA3)標(biāo)準(zhǔn)品、CNW C18 QuEChers填料、色譜級甲醇、乙腈、乙腈（樣品提取液）。
2．儀器設(shè)備
（1）TG-16G臺式高速離心機(jī)、電子天平、Agilent 1290高效液相色譜儀、SCIEX-6500Qtrap(MSMS)、氣浴恒溫?fù)u床、超聲清洗儀、水浴氮吹儀。
3.標(biāo)曲溶液配置
（1）取甲醇溶液990 μl加入1.5 ml離心管，加入500 μg/ml每種激素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各2 μl，震蕩均勻，配置為終濃度1 μg/ml的使用母液以備后續(xù)使用。
（2）取甲醇溶液999.9 μl、999.8 μl、999.5 μl、999 μl、998 μl、995 μl、980 μl分別加入1.5 ml離心管，而后取步驟（1）中配置的母液分別0.1 μl、0.2 μl、0.5 μl、1 μl、2 μl、5 μl、20 μl順序加入上述甲醇溶液中，配置為終濃度0.1 ng/ml、0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、20 ng/ml的標(biāo)曲溶液。
4.流動相配置
（1）有機(jī)相：取色譜純甲醇900 ml加入1 L容量瓶，加入1 ml甲酸，以甲醇定容至1 L，顛倒混勻。
（2）無機(jī)相：取超純水900 ml加入1 L容量瓶，加入1 ml甲酸，以超純定容至1 L，顛倒混勻。
5.植物激素提取
（1）準(zhǔn)確稱取樣品約0.3-0.8 g，加入10倍體積乙腈溶液；
（2）4℃提取過夜，12000 g離心5 min，取上清液；
（3）沉淀再次加入5倍體積乙腈溶液，提取兩次，合并所得上清液；
（4）加入15-40 mg C18填料，劇烈震蕩30 s，10000 g離心5 min，取上清液；
（5）氮?dú)獯蹈?，?00 μl甲醇復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，放入-20℃冰箱待上機(jī)檢測。
（6）進(jìn)樣體積：2 μl。
6 實(shí)驗結(jié)果與分析
（1）植物樣品中激素含量(ng/g)=檢測濃度(ng/ml)×稀釋體積(ml)/稱取質(zhì)量(g)
其中稀釋體積為樣品最終溶解進(jìn)樣時所用的溶液體積，稱取質(zhì)量為提取時的取樣質(zhì)量。
（2）檢測濃度由待測物質(zhì)峰面積代入標(biāo)曲方程，由儀器自動求得。
表：GA3檢測結(jié)果?
樣品名稱 | 稀釋體積(ml) | 稱取質(zhì)量(g) | 檢測濃度(ng/ml) | 激素含量(ng/g) |
1 | 0.200 | 0.734 | 0.32 | 0.087 |
2 | 0.200 | 0.833 | 0.26 | 0.062 |
3 | 0.200 | 0.319 | 0.29 | 0.18 |
4 | 0.200 | 0.684 | 0.25 | 0.073 |
GA3標(biāo)準(zhǔn)曲線
?
校準(zhǔn)曲線
物質(zhì)名稱 | 校正曲線 | 相關(guān)系數(shù)R2 | 權(quán)重 | 線性范圍(ng) |
GA3 | y = 7193.05815 x + 186.40775 | 0.99298 | 1/X2 | 0.1-20 |
討論：赤霉素在植物組織中含量低種類多紫外檢測信號弱使得同時定性定量測定多種赤霉素比較困難。利用熒光分光光度法陽和紫外分光光度法測定赤霉素靈敏度低且樣本間誤差比較大。利用LC-MS和GC-MS測定赤霍素準(zhǔn)確性高，但儀器價格昂貴且測試費(fèi)用較高。因此有相關(guān)研究開發(fā)準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)適用的赤霉素測試方法，例如凝膠滲透色譜（GPC）及HPLC定量測定植物組織中GAs的方法。