? ? ? ? 可溶性蛋白指可以以小分子狀態(tài)溶于水或其他溶劑的蛋白。通常在植物生理、微生物、食品加工等實(shí)驗(yàn)中作為重要指標(biāo)。如可溶性蛋白是植物抗旱性的重要指標(biāo)之一。今天栢暉生物就給大家分享一下如何通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定植物中的可溶性蛋白：
“1試劑
所有試劑除注明者外，均為分析純。
1.1 考馬斯亮藍(lán)溶液配制：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸餾水定容到1L。在過(guò)夜后過(guò)濾并貯于棕色瓶中，常溫下可保存一個(gè)月。
1.2 90% 乙醇
1.3 100 g/ml 牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取10mg BSA定容至100 ml即為100 g/ml。或稱取25 mg BSA加蒸餾水水溶解后定容至100 ml，再?gòu)闹形?0 ml蒸餾水定容至100ml。
1.4 0.05 mol/LpH7.8磷酸配制：
A母液，0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液：取Na2HPO4·12H2O (分子量358.14)35.85 g，用蒸餾水定容至500 ml。
B母液，0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4·2H2O (分子量156.01)1.5601 g，用蒸餾水定容到50 ml。
1.5 0.05M pH7.8磷酸：分別取A母液228.75ml，B母液21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。
“2主要儀器
萬(wàn)分之一分析天平、紫外可見分光光度計(jì)、離心機(jī)
“3試樣的制備
取風(fēng)干的實(shí)驗(yàn)室待測(cè)樣品充分混勻后，籽粒全部通過(guò) 0.25mm（秸稈通過(guò) 0.5mm）孔徑篩，裝入樣品瓶備用。
“4分析步驟
4.1 試樣溶液制備
樣品提?。喝□r樣0.2—0.5g，用蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后，3000r/min—4000r/min離心10min，上清液備用。
4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
取6支具塞試管，依次加入標(biāo)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，然后用蒸餾水補(bǔ)充至1ml，再向各管中加入5ml考馬斯亮藍(lán)試劑，5min左右，以0號(hào)試管為空白對(duì)照，在595nm下比色測(cè)定吸光度，以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4.3 樣品的測(cè)定
吸取樣品提取液1.0ml（視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋），放入試管中（每個(gè)樣品重復(fù)兩次），加入5ml考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，放置2min待反應(yīng)完成，在595nm下比色，測(cè)定吸光度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查蛋白質(zhì)含量。
“5結(jié)果計(jì)算
式中：
C—查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，g；
Vt—提取液總體積，ml；
WF—樣品鮮重，g；
Vs—測(cè)定時(shí)加樣量，ml
所得結(jié)果應(yīng)保留小數(shù)點(diǎn)后三位