Abstract:?Understanding the effects of changing climate and long-term human activities on soil organic carbon (SOC) and the?mediating roles of microorganisms is critical to maintain soil C stability in agricultural ecosystem. Here, we took samples?from a long-term soil transplantation experiment, in which large transects of Mollisol soil in a cold temperate region were?translocated to warm temperate and mid-subtropical regions to simulate different climate conditions, with a fertilization?treatment on top. This study aimed to understand fertilization effect on SOC and the role of soil microorganisms featured?after long-term community incubation in warm climates. After 12 years of soil transplantation, fertilization led to less?reduction of SOC, in which aromatic C increased and the consumption of O-alkyl C and carbonyl C decreased. Soil live?microbes were analyzed using propidium monoazide to remove DNAs from dead cells, and their network modulization?explained 60.4% of variations in soil labile C. Single-cell Raman spectroscopy combined with D2O isotope labeling?indicated a higher metabolic activity of live microbes to use easily degradable C after soil transplantation. Compared with?non-fertilization, there was a significant decrease in soil α- and β-glucosidase and delay on microbial growth with?fertilization in warmer climate. Moreover, fertilization significantly increased microbial necromass as indicated by amino?sugar content, and its contribution to soil resistant C reached 22.3%. This study evidentially highlights the substantial?contribution of soil microbial metabolism and necromass to refractory C of SOC with addition of nutrients in the long-term.

摘要：了解氣候變化和人類長期活動(dòng)對土壤有機(jī)碳（SOC）的影響以及微生物的調(diào)控作用是維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)土壤C穩(wěn)定的關(guān)鍵。本研究進(jìn)行了一個(gè)長期土壤移置實(shí)驗(yàn)即將寒溫帶的黑土遷移至暖溫帶和中亞熱帶地區(qū)以模擬不同的氣候條件，并在頂部進(jìn)行施肥處理。研究旨在了解在溫暖氣候條件下長期群落培養(yǎng)后，施肥對土壤有機(jī)碳的影響以及土壤微生物的作用。土壤移置12年后，施肥導(dǎo)致SOC減少，其表現(xiàn)為芳香C的增加，以及氧烷基C和羰基C的減少。用疊氮溴化丙錠去除死細(xì)胞中的DNAs后，對土壤中活的細(xì)菌群落進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其網(wǎng)絡(luò)模塊化解釋了60.4%的土壤易分解C變化。單細(xì)胞拉曼光譜結(jié)合D₂O同位素標(biāo)記表明土壤移置后活微生物對易降解碳的代謝活性較高。與不施肥相比，氣候變暖與施肥條件下，土壤α-和β-葡萄糖苷酶活性顯著降低，微生物生長延緩。此外，施肥顯著增加了土壤微生物殘?bào)w（necromass，以氨基糖含量為指標(biāo)），其對土壤頑固性碳的貢獻(xiàn)率達(dá)22.3%。本研究強(qiáng)調(diào)了土壤微生物代謝和殘?bào)w對土壤穩(wěn)定性有機(jī)碳固存的重要貢獻(xiàn)。

研究背景：

土壤SOC是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最大的C庫，其動(dòng)態(tài)變化直接影響全球C平衡。土壤C和氮（N）循環(huán)緊密耦合，并很大程度上受氣候變化和人類活動(dòng)的影響。長期施肥增加了土壤養(yǎng)分有效性，并顯著地影響土壤C動(dòng)態(tài)。盡管施肥具有增加土壤C儲(chǔ)量的潛力，但就長期而言，土壤C穩(wěn)定性取決于未來氣候變化。土壤有機(jī)碳對長期施肥的響應(yīng)程度和方向受溫度和降水的影響。根據(jù)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的長期野外觀測和模型模擬，發(fā)現(xiàn)土壤養(yǎng)分和氣候因子的交互影響決定了32%土壤有機(jī)碳的變異，并與微生物代謝、酶活性和殘?bào)w微生物周轉(zhuǎn)密切相關(guān)。

土壤微生物不僅能分解土壤有機(jī)質(zhì)，還能代謝植物殘?bào)w或通過合成代謝形成殘?bào)w來穩(wěn)定土壤C。微生物殘?bào)w通常與土壤礦物質(zhì)表面緊密結(jié)合而形成相對穩(wěn)定的C。土壤微生物碳泵理論表明，微生物通過體外修飾（ex vivo?modification）和體內(nèi)周轉(zhuǎn)（in vivo?turnover）來調(diào)節(jié)土壤碳的積累。這意味著作為難降解C源，微生物代謝產(chǎn)物或殘?bào)w對有機(jī)碳的貢獻(xiàn)很大，而養(yǎng)分或易降解C的添加也可以長期增加土壤有機(jī)質(zhì)。這一過程受到多因素環(huán)境變化的強(qiáng)烈影響。因此，需要進(jìn)一步研究不同氣候條件和長期施肥下微生物生理代謝和殘?bào)w對土壤碳的貢獻(xiàn)，以更好地理解農(nóng)業(yè)土壤有機(jī)碳的積累和穩(wěn)定性。

主要結(jié)果：

1.?施肥對不同氣候條件下SOC數(shù)量與質(zhì)量的影響

土壤移置12年后，在較溫暖的氣候條件下，SOC的損失顯著減少（TransS2處理）（Fig.?1a）。施肥顯著提高了TransS2處理下土壤頑抗性碳組分（RC）中的芳香C含量，其芳香度指數(shù)是Trans S2處理的2.7倍?（Fig. 1a, b）,表明了在溫暖的氣候條件下，施肥促進(jìn)了腐殖化過程。對于土壤活性C組分（LC）而言，氣候變暖條件下未施肥土壤中氧烷基C和羰基C降低，而施肥顯著減緩了LC的損失。TransS2處理土壤在施肥后烷基/氧烷基C比率的降低（Fig. 1b）表明了施氮對易分解C的消耗具有潛在抑制作用。

圖1?土壤移置12年后，不同氣候條件下施肥對土壤有機(jī)碳及其分子群的影響。a代表在不同氣候條件下（TransS1表示寒溫帶土壤移至暖溫帶；TransS2表示寒溫帶土壤移至亞熱帶）施肥對SOC以及其分子類群（烷基C，O-烷基C，縮醛C，芳香C和羰基C）的影響；b中A/O-A%（%）=烷基C峰面積（0-45 ppm）/O-烷基C峰面積（45-90 ppm）*100%，芳香性程度（%）=芳香C峰面積（110-160 ppm）/總峰面積（0-160 ppm）*100%。圖中*，**，***分別代表p < 0.05，p < 0.01和***p < 0.001。

2.?活細(xì)菌群落和總微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化

施肥顯著改變了不同氣候條件下細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)（Fig. 2a）,?增加活細(xì)菌α-多樣性，降低總細(xì)菌α-多樣性。與土壤地球化學(xué)屬性的影響相比，施肥和氣候因子（MAT和MAP）是改變活微生物群落結(jié)構(gòu)和總微生物群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素（Table?1）。

Fig.?2?活微生物和總微生物的群落組成及模塊化分析。a代表活細(xì)菌群落和總細(xì)菌群落組成的比較，圖中僅顯示了相對豐度排名前十的細(xì)菌門，其他細(xì)菌門均表示為“其他門”；b基于隨機(jī)森林模型，在活微生物和總微生物中排名前八的網(wǎng)絡(luò)模塊對土壤不穩(wěn)定碳（LC）成分變化的貢獻(xiàn)。

Table 1?微生物群落組成與土壤理化性質(zhì)（pH，SOC，TN，TP，NO3--N, NH4+-N），氣候條件變化和施肥之間Mantel及偏Mantel檢驗(yàn)。

? ? ? ? ?3.?活微生物/總微生物比與土壤易分解碳和頑固性碳之間的關(guān)系

隨機(jī)森林模型中有5個(gè)活微生物模塊和3個(gè)總微生物模塊對LC變化有顯著貢獻(xiàn)，解釋率分別為60.4%和44.9%（Fig.?2b）?？偽⑸飳?/span>RC的貢獻(xiàn)率（78.81%）高于活微生物(70.69%)?（Fig.?2b）。

4.?活微生物對碳組分貢獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)分析

通過Raman-D₂O法研究了活細(xì)菌的代謝活性，確定其在土壤移植后的降解能力（Fig.?3)。采用不同的基質(zhì)（淀粉和纖維素）以及D₂O培養(yǎng)細(xì)菌，其培養(yǎng)物在2040~2300 cm^-1范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的C -D拉曼譜帶。以淀粉為C源的情形下，?TransS1和TransS2的C-D/（C-D + C-H）比值顯著高于原位處理，而以纖維素為C源的情形下則趨勢相反。

Fig. 3?在施肥土壤中，以D2O同位素標(biāo)記同時(shí)結(jié)合單細(xì)胞Raman光譜技術(shù)探究不同碳源培養(yǎng)條件下土壤微生物的代謝活性。a?左側(cè)代表拉曼光譜，右側(cè)代表?C-D比率（C-D/（C-D+C-H））以及在50% D2O的無機(jī)鹽+淀粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后土壤細(xì)菌的拉曼mapping圖；b代表拉曼光譜，C-D比率以及在無機(jī)鹽+纖維素培養(yǎng)基中培養(yǎng)的土壤細(xì)菌的拉曼mapping圖；**和***分別代表p < 0.01和p < 0.001。

施肥顯著降低了TransS2中土壤α-和β-葡萄糖苷酶活性（Fig. 4a）。通過接種土壤懸浮液測試活體微生物對不同C源（淀粉和纖維素）分解能力的實(shí)驗(yàn)顯示施肥顯著降低了淀粉和纖維素分解所產(chǎn)生的CO₂（Fig.?4b），這表明施肥減少了TransS2土壤不穩(wěn)定碳和穩(wěn)定碳的損失。此外，分別繪制了活細(xì)菌在淀粉和纖維素中的生長曲線（Fig. 4c）。在較溫暖的氣候條件下，施肥土壤中細(xì)菌的生長活性低于未施肥土壤。特別是在以淀粉為碳源的情況下，施肥土壤中的細(xì)菌加速進(jìn)入穩(wěn)定期，而未施肥土壤中的細(xì)菌持續(xù)生長。

Fig.?4?不同氣候條件下施肥對不同碳源的土壤微生物代謝能力和生長的影響。a代表土壤酶活性（α-和β-葡萄糖苷酶）；b代表微生物降解淀粉和纖維素能力的微環(huán)境實(shí)驗(yàn)；c代表以淀粉和纖維素為C源培養(yǎng)條件下活的土壤微生物的生長曲線（n=9）。

? ? ? ? ?5.?基于氨基糖分析探究微生物殘?bào)w對SOC?的貢獻(xiàn)

在TransS2處理下，施肥顯著增加微生物殘?bào)w含量（Fig.?5a）。土壤移置12年后，微生物死生物質(zhì)的積累增加。采用偏RDA方法估算了土壤中活體微生物和死微生物以及土壤地球化學(xué)屬性對LC和RC組分的貢獻(xiàn)（Fig. 5b）：活細(xì)菌對LC組分的貢獻(xiàn)率為30.9%，遠(yuǎn)高于死微生物對LC組分的貢獻(xiàn)率（1.1%）。死亡微生物對RC組分的貢獻(xiàn)率為22.3%，高于活微生物（6.4%），表明了微生物殘?bào)w可能是土壤RC的主要貢獻(xiàn)者。

基于微生物?C泵理論，微生物代謝產(chǎn)物或殘?bào)w可以對RC-SOC有很大的貢獻(xiàn)，這強(qiáng)調(diào)微生物在碳吸存過程中的調(diào)節(jié)作用。本研究構(gòu)建了一個(gè)概念框架，以揭示在氮缺乏和充足的情況下，微生物生理代謝和殘?bào)w調(diào)控SOC吸存的潛在作用機(jī)制（圖6）。在溫暖氣候條件下，施肥可通過促進(jìn)微生物殘?bào)w的積累來補(bǔ)充土壤中的頑固性碳（芳香族C），同時(shí)降低活微生物對不穩(wěn)定的C組分的消耗來增加土壤C吸存。

Fig. 5?微生物死生物質(zhì)對土壤SOC的貢獻(xiàn)。a代表作為微生物殘?bào)w生物標(biāo)志物的土壤氨基糖含量，包括來自死真菌的氨基葡萄糖和來自死細(xì)菌的氨基半乳糖和胞壁酸，大寫字母表示不同氣候條件下施肥效應(yīng)具有顯著差異，小寫字母表示原位與移栽之間具有顯著差異；b代表土壤地球化學(xué)性質(zhì)、活細(xì)菌生物量和細(xì)菌氨基糖含量對土壤LC和RC影響的偏冗余分析（pRDA）。

Fig. 6不同氣候條件下施肥與非施肥土壤微生物對有機(jī)碳分子群的潛在調(diào)控機(jī)制示意圖。上圖中土壤顏色梯度反映了LC和RC分量的變化，高度代表了SOC的含量。左下圖表示了不同氣候條件下氮素限制或充足對微生物SOC代謝的影響機(jī)制。在不施肥的情況下，由于氮素的限制，植物和微生物可能會(huì)發(fā)出更強(qiáng)的氮饑餓信號，微生物產(chǎn)生更多的胞外酶分解有機(jī)碳以獲得氮源。此外，氮素缺乏減少了植物根系分泌物(易于降解的碳源)的輸入，增溫加速了土壤中不穩(wěn)定碳的消耗，進(jìn)一步刺激了土壤中微生物呼吸對穩(wěn)定碳的利用，導(dǎo)致土壤有機(jī)碳的減少。在施肥情況下，土壤微生物殘?bào)w的增加補(bǔ)充了土壤不穩(wěn)定碳，低氮饑餓信號降低了微生物對土壤穩(wěn)定碳的消耗。