原名：Network analysis and subsequent culturing reveal keystone taxa involved in microbial litter decomposition dynamics
譯名：網(wǎng)絡(luò)分析和后續(xù)培養(yǎng)揭示了參與微生物凋落物分解動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵類群
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：8.5
發(fā)表時(shí)間：2021.6
通訊作者：徐陽(yáng)春
主要單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院
土壤中植物凋落物的分解由定殖在凋落物殘?bào)w上的細(xì)菌和真菌等微生物驅(qū)動(dòng)，因此，細(xì)菌和真菌群落的相互作用可以揭示木質(zhì)素的分解機(jī)制。以往的研究主要是在微生境、異地條件或單一土壤生態(tài)系統(tǒng)中研究凋落物分解的微生物群落。而本研究通過(guò)為期12周的室內(nèi)凋落物（秸稈）分解實(shí)驗(yàn)，探討三種不同利用類型（林地、農(nóng)田和棄耕地）的土壤中凋落物分解與酶活性和微生物群落變化的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)：（1）三類土壤中林地凋落物的分解程度最高；（2）然后，我們用多種方法證明了這是由微生物群落決定的，林地土壤微生物群落具有更高活性的木質(zhì)素分解酶，更高的微生物多樣性，以及不復(fù)雜但更專門(mén)化的網(wǎng)絡(luò)。細(xì)菌中的Chryseobacterium（金黃桿菌屬）和真菌中的Fusarium（鐮刀菌屬）、Aspergillus（曲霉菌屬）、Penicillium（青霉菌屬）是三類土壤微生物網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵類群；（3）我們隨后開(kāi)展了分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了這些關(guān)鍵類群具有高的凋落物分解能力和酶活性。本研究首次驗(yàn)證了微生物關(guān)鍵類群在凋落物分解中的作用，網(wǎng)絡(luò)分析與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)合被證明是篩選微生物關(guān)鍵類群的可選模式。總體而言，我們的結(jié)果說(shuō)明，土地利用類型通過(guò)土壤微生物群落的組成和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響凋落物的分解。我們的研究還揭示了特定的關(guān)鍵微生物類群參與了凋落物的分解，未來(lái)或許可以利用這些關(guān)鍵類群來(lái)調(diào)控土壤生態(tài)系統(tǒng)中木質(zhì)素的分解。
1. 凋落物分解及其質(zhì)量的變化隨著時(shí)間的推移，土地利用類型對(duì)凋落物分解有明顯影響，在第2周和第12周，林地的凋落物分解率最高，而棄耕地的凋落物分解率最低。在第12周后，林地、農(nóng)田和棄耕地凋落物的分解率分別達(dá)到63.42%、53.75%和50.38%（圖1-a）。林地凋落物分解常數(shù)顯著高于耕地和棄耕地。土地利用類型和時(shí)間對(duì)凋落物分解都有顯著影響。不同土地利用類型的凋落物組成也有顯著變化（圖1 b-d）。土地利用類型和時(shí)間都會(huì)影響凋落物質(zhì)量的變化。
圖1. 林地、農(nóng)田和棄耕地凋落物分解及質(zhì)量變化
2. 酶活性的變化不同土地利用類型的纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、β-木聚糖酶和漆酶的活性也存在顯著差異（圖2 a-d）。在整個(gè)采樣期間（包括初始時(shí)間），林地中的所有酶活性均顯著高于農(nóng)田和棄耕地，但是每種酶的活性表現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。四種酶活性的總酶活性（Z-score）顯示：林地的總酶活性顯著高于其他兩個(gè)位點(diǎn)（圖S3）。木質(zhì)素酶活性與凋落物分解呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.001，圖2-e)。具體而言，β-葡萄糖苷酶與三種土壤的纖維素和半纖維素顯著相關(guān)。漆酶與木質(zhì)素也顯著相關(guān)。土地利用類型和時(shí)間都顯著影響凋落物質(zhì)量的變化。這些結(jié)果表明，三種土壤的凋落物分解與相關(guān)酶活性之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。
圖2. 林地、農(nóng)田和棄耕地中（a）纖維二糖水解酶、（b）β-葡萄糖苷酶、（c）β-木聚糖酶和（d）漆酶的變化。（e）四種纖維素酶活的總和（Z-score）與凋落物分解的關(guān)系
3. 凋落物分解過(guò)程中微生物群落的演替細(xì)菌和真菌群落都隨時(shí)間顯著變化。富集培養(yǎng)2-12周后，秸稈表面的微生物群落與初始樣品（未培養(yǎng)前）的微生物群落明顯不同。在前期和后期，林地土壤的細(xì)菌總量（絕對(duì)豐度）都顯著高于農(nóng)田和棄耕地（圖3-a）。凋落物開(kāi)始分解后，細(xì)菌的OTU豐富度立即下降（圖3-c），表明摻入秸稈后來(lái)自土體的細(xì)菌群落開(kāi)始發(fā)揮作用（分解秸稈）。隨著分解的進(jìn)行，細(xì)菌OTU豐富度隨時(shí)間增加，在第6周和第8周達(dá)到最高，然后再下降（圖3-c）。林地土壤的細(xì)菌群落與農(nóng)田和棄耕地土壤的細(xì)菌群落不同（圖3-e），并且這些差異在整個(gè)采樣期間都十分明顯。凋落物分解過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）和綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）（圖3-g）。三種土壤中這些優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的變化趨勢(shì)不同。另外，在林地中，只有細(xì)菌的β多樣性（PCoA1）與木質(zhì)素呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果表明，在凋落物分解過(guò)程中細(xì)菌群落隨不同生態(tài)系統(tǒng)類型（土壤類型）而變化。一般來(lái)說(shuō)，真菌群落只受土壤類型的影響。在所有時(shí)間點(diǎn)，林地真菌的絕對(duì)豐度顯著高于農(nóng)田和棄耕地（圖3-b）。與細(xì)菌群落類似，在第2周真菌的OTU豐富度顯著下降（圖3-d）。在第2周和第6周，林地真菌的OTU豐度顯著高于其他兩種土壤（圖3-d)。林地真菌的群落結(jié)構(gòu)與農(nóng)田和棄耕地也顯著不同（圖3-f），這種差異在第0、2、6和12周的表現(xiàn)一致。凋落物分解過(guò)程中（包括三種土壤和所有采樣時(shí)間）的優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)為子囊菌門(mén)（Ascomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）（占總序列的70-99%；圖3-h）。在第4周和第6周，擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）在農(nóng)田和棄耕地中占主導(dǎo)地位，包括Coprinopsis和Psathyrella屬。
圖3. 凋落物分解實(shí)驗(yàn)（12周）中，林地、農(nóng)田和棄耕地土壤細(xì)菌和真菌的總豐度、多樣性、群落結(jié)構(gòu)及分類組成的變化
4. 微生物共生網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵類群三種土壤的網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度差異較大。與農(nóng)田和棄耕地相比，林地微生物網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度較低（圖4-a和b)。棄耕地的微生物網(wǎng)絡(luò)最為復(fù)雜，其邊數(shù)、平均度和聚類系數(shù)均高出（林地微生物網(wǎng)絡(luò)）2倍（圖4-b）。關(guān)鍵微生物類群主要屬于細(xì)菌中的放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），以及真菌中的子囊菌門(mén)（Ascomycota）。刪去關(guān)鍵類群OTU后，我們重構(gòu)了三種土壤的共生網(wǎng)絡(luò)，以評(píng)估其對(duì)網(wǎng)絡(luò)的影響。結(jié)果表明，如果沒(méi)有關(guān)鍵類群的OTU，微生物網(wǎng)絡(luò)就會(huì)變得更簡(jiǎn)單。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些關(guān)鍵類群，我們將篩選出60個(gè)關(guān)鍵類群OTU與可培養(yǎng)的34株細(xì)菌和17株真菌菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育地位匹配。結(jié)果顯示，60株中有5株為可培養(yǎng)的菌株，其中林地（TU3451，Penicillium sp.ZJ-F2；TU3409，F(xiàn)usarium sp.ZJ-F3）、農(nóng)田（OTU10384，Chryseobacterium sp.QL-B4；TU84，Aspergillus aculeatus QL-F3）和棄耕地（TU1317，Aspergillussp.BG-F2）（圖4-b）。
圖4.三類土壤中細(xì)菌和真菌OTUs共生網(wǎng)絡(luò)
5. 潛在關(guān)鍵物種的（凋落物）分解效能。我們進(jìn)一步對(duì)這5個(gè)關(guān)鍵菌株（Penicillium sp.ZJ-F2、Fusariumsp.ZJ-F3、Chryseobacterium sp.QL-B4、Aspergillusaculeatus QL-F3、Aspergillus sp.BG-F2）的凋落物分解能力進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來(lái)自林地的Penicillium sp.ZJ-F2菌株的凋落物分解能力顯著高于其他兩種類型的土壤（圖5-a)。此外，F(xiàn)usariumsp. ZJ-F3菌株和Aspergillussp.BG-F2菌株的凋落物分解能力顯著高于Chryseobacterium sp.QL-B4和Aspergillusaculeatus QL-F3菌株（圖5-a)。Penicillium sp. ZJ-F2菌株還具有最高的纖維二糖水解酶、β-木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和漆酶活性（圖S13）。用Z-score計(jì)算四種酶活的總活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Penicilliumsp. ZJ-F2菌株的Z-score最高、凋落物分解能力最強(qiáng)；Chryseobacterium sp.QL-B4的Z-score最低、凋落物分解能力最差（圖5-b）。相關(guān)性分析進(jìn)一步證實(shí)了凋落物分解與關(guān)鍵類群（凋落物分解與Z-score值正相關(guān)）之間的相關(guān)性（圖5-c）。這些結(jié)果表明，可通過(guò)構(gòu)建共生網(wǎng)絡(luò)初步篩選潛在的關(guān)鍵微生物類群以進(jìn)一步探索相關(guān)的微生物功能。
圖5.秸稈液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（7天）中，凋落物分解的關(guān)鍵類群和四種纖維素酶活的總和（Z-score）
在凋落物分解過(guò)程中，木質(zhì)素分解酶活性、微生物群落結(jié)構(gòu)和共生模式（網(wǎng)絡(luò)）發(fā)生了變化，這些變化受土地利用類型的影響。具體而言，林地土壤凋落物分解程度較高的原因是木質(zhì)素降解酶活性較高、微生物多樣性較高、微生物網(wǎng)絡(luò)不那么復(fù)雜但更為專門(mén)化。因此，我們的結(jié)果表明，土地利用類型影響的土壤微生物演替介導(dǎo)的土壤凋落物分解。基于共生網(wǎng)絡(luò)分析和后續(xù)的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，我們確定了土壤凋落物分解相關(guān)的關(guān)鍵類群。這些類群表現(xiàn)出很強(qiáng)的凋落物分解能力和酶活性。網(wǎng)絡(luò)分析與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)合是篩選微生物關(guān)鍵類群的可選模式。此外，強(qiáng)調(diào)了通過(guò)網(wǎng)絡(luò)評(píng)分確定的關(guān)鍵分類群可以通過(guò)培養(yǎng)篩選來(lái)表征。此外，這是一次利用統(tǒng)計(jì)經(jīng)驗(yàn)驗(yàn)證微生物工程和代謝模型中關(guān)鍵類群的成功嘗試。