赤霉素(Gibberellins,GAs)作為植物體內(nèi)廣泛存在的一類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是高等植物體內(nèi)的一類四環(huán)二萜羧酸化合物,參與調(diào)控植物種子萌發(fā),下胚軸伸長(zhǎng),葉片伸展,花、果實(shí)及種子發(fā)育等諸多生理過(guò)程。截至1976 年就從植物中分離鑒定出32種赤霉素，至今,發(fā)現(xiàn)的赤霉素的種類己有百種之多。

研究表明,赤霉素在植物抵抗非生物脅迫中也發(fā)揮著重要作用,主要通過(guò)調(diào)節(jié)GAs的生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其生物活性,以提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。

一、實(shí)驗(yàn)方法及原理

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取樣品中植物內(nèi)源激素，再以安捷倫1290高效液相色譜儀串聯(lián)AB公司Qtrap6500質(zhì)譜儀，測(cè)定植物內(nèi)源激素。

1.試劑

以下所有試劑如無(wú)特別注明，均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，去離子水或相當(dāng)純度的水。

赤霉素(GA3)標(biāo)準(zhǔn)品、CNW C18 QuEChers填料、色譜級(jí)甲醇、乙腈、乙腈（樣品提取液）。

2．儀器設(shè)備

（1）TG-16G臺(tái)式高速離心機(jī)、電子天平、Agilent 1290高效液相色譜儀、SCIEX-6500Qtrap(MSMS)、氣浴恒溫?fù)u床、超聲清洗儀、水浴氮吹儀。

3.標(biāo)曲溶液配置

（1）取甲醇溶液990 μl加入1.5 ml離心管，加入500 μg/ml每種激素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液各2 μl，震蕩均勻，配置為終濃度1 μg/ml的使用母液以備后續(xù)使用。

（2）取甲醇溶液999.9 μl、999.8 μl、999.5 μl、999 μl、998 μl、995 μl、980 μl分別加入1.5 ml離心管，而后取步驟（1）中配置的母液分別0.1 μl、0.2 μl、0.5 μl、1 μl、2 μl、5 μl、20 μl順序加入上述甲醇溶液中，配置為終濃度0.1 ng/ml、0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、20 ng/ml的標(biāo)曲溶液。

4.流動(dòng)相配置

（1）有機(jī)相：取色譜純甲醇900 ml加入1 L容量瓶，加入1 ml甲酸，以甲醇定容至1 L，顛倒混勻。

（2）無(wú)機(jī)相：取超純水900 ml加入1 L容量瓶，加入1 ml甲酸，以超純定容至1 L，顛倒混勻。

5.植物激素提取

（1）準(zhǔn)確稱取樣品約0.3-0.8 g，加入10倍體積乙腈溶液；

（2）4℃提取過(guò)夜，12000 g離心5 min，取上清液；

（3）沉淀再次加入5倍體積乙腈溶液，提取兩次，合并所得上清液；

（4）加入15-40 mg C18填料，劇烈震蕩30 s，10000 g離心5 min，取上清液；

（5）氮?dú)獯蹈?，?00 μl甲醇復(fù)溶，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜，放入-20℃冰箱待上機(jī)檢測(cè)。

（6）進(jìn)樣體積：2 μl。

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）植物樣品中激素含量(ng/g)=檢測(cè)濃度(ng/ml)×稀釋體積(ml)/稱取質(zhì)量(g)

其中稀釋體積為樣品最終溶解進(jìn)樣時(shí)所用的溶液體積，稱取質(zhì)量為提取時(shí)的取樣質(zhì)量。

（2）檢測(cè)濃度由待測(cè)物質(zhì)峰面積代入標(biāo)曲方程，由儀器自動(dòng)求得。

表：GA3檢測(cè)結(jié)果?

GA3標(biāo)準(zhǔn)曲線

?

校準(zhǔn)曲線

討論：赤霉素在植物組織中含量低種類多紫外檢測(cè)信號(hào)弱使得同時(shí)定性定量測(cè)定多種赤霉素比較困難。利用熒光分光光度法陽(yáng)和紫外分光光度法測(cè)定赤霉素靈敏度低且樣本間誤差比較大。利用LC-MS和GC-MS測(cè)定赤霍素準(zhǔn)確性高，但儀器價(jià)格昂貴且測(cè)試費(fèi)用較高。因此有相關(guān)研究開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)適用的赤霉素測(cè)試方法，例如凝膠滲透色譜（GPC）及HPLC定量測(cè)定植物組織中GAs的方法。