實(shí)驗(yàn)材料：
植物樣：青稞種子
實(shí)驗(yàn)步驟：
準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g經(jīng)研磨的樣本，放在100ml的燒杯中，先以少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加50ml蒸餾水，攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。離心或過(guò)濾，用20ml蒸餾水洗殘?jiān)?，再離心或過(guò)濾，將兩次離心的上清液或?yàn)V液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測(cè)液。
02：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)取7支具有25ml刻度的血糖管或刻度試管，編號(hào)，按比例精確加入濃度為1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3,5-二硝基水楊酸試劑。將各管搖勻，在沸水浴中加熱5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至25ml刻度處，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻（如用大試管，則向每管加入21.5ml蒸餾水，混勻）。在540nm波長(zhǎng)下，用0號(hào)管調(diào)零，分別讀取1～6號(hào)管的消光值。以消光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖mg為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得直線(xiàn)方程。
取3支25ml刻度試管，編號(hào)，分別加入還原糖待測(cè)液2ml，3,5-二硝基水楊酸試劑1.5ml，其余操作均與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相同，測(cè)定各管的吸光值。
分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出相應(yīng)還原糖mg數(shù)，計(jì)算還原糖百分含量。
1、DNS法
測(cè)各種還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)原理:3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)在堿性條件下與還原糖的還原末端反應(yīng)生成橙黃至棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈正比例關(guān)系。
??引伸：植物還原糖檢測(cè)試劑盒是還原糖在堿性條件下被氧化成糖酸，3,5-二硝基水楊酸被還原為棕紅色的氨基化合物。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色產(chǎn)物的顏色深淺程度呈一定比例關(guān)系。測(cè)定棕紅色物質(zhì)的吸光度，該吸光度值與還原糖含量呈線(xiàn)性關(guān)系，利用比色法和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)得樣品中的還原糖的含量。
2、鐵氰化鉀法
根據(jù)蔗糖的非還原性，用生成物（葡萄糖和果糖）能夠還原菲林溶液中的銅，再根據(jù)生成的氧化亞銅的量求出糖的含量。先制備還原糖待測(cè)混合液，通過(guò)0.1N的硫代硫酸鈉滴定，達(dá)到當(dāng)量點(diǎn)前，注入淀粉指示劑滴定至藍(lán)色消失。土壤的轉(zhuǎn)化酶活性，以單位土重的0.1N硫代硫酸鈉毫升數(shù)（對(duì)照與試驗(yàn)測(cè)定的差）表示。
測(cè)各種還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)原理:鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6〕本身為黃色(吸收峰在420nm)左右，而與還原糖反應(yīng)可生成無(wú)色的亞鐵氰化鉀[K4?Fe( CN)6?]，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈反比例關(guān)系。
????討論：該法是還原糖檢測(cè)的經(jīng)典方法，鐵氰化鉀本身為黃色，與還原糖反應(yīng)后生成無(wú)色的亞鐵氰化鉀。
3、MBTH法
測(cè)各種還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)原理:MBTH(3-甲基-2-苯并噻唑酮腙,3-methyl-2-benzothiazolinone hydrozone)首先與還原糖反應(yīng)生成嗪，過(guò)量的MBTH被Fe+3氧化成陽(yáng)離子，再與嗪反應(yīng)生成青藍(lán)色化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈正比例關(guān)系。
??討論：該法為還原糖測(cè)定的新方法。在氧化反應(yīng)過(guò)程中MBTH 失去兩個(gè)電子和一個(gè)質(zhì)子，形成了親電子中間體，這一中間體被假設(shè)是具有活性的耦合化合物，中間體再與嗪反應(yīng)。
總結(jié)：
比較三種方法測(cè)還原糖的精密度和回收率，MBTH法的靈敏度最高，鐵氰化鉀法次之，DNS法的靈敏度最低。MBTH法靈敏度高，測(cè)定不受蛋白質(zhì)、醋酸鹽和琥珀酸鹽緩沖液的干擾，對(duì)于不同聚合度的同類(lèi)還原糖，其還原端的顯色吸光系數(shù)基本相同，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，它特別適合于多糖水解酶的低酶活測(cè)定或DON酶聯(lián)免疫加標(biāo)測(cè)定；DNS法雖然操作穩(wěn)定，精密度高，但此法靈敏度相對(duì)較低，用此法測(cè)定微量多糖水解酶，如飼料添加劑中木聚糖酶活力時(shí)，則無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定；
鐵氰化鉀法靈敏度高于DNS法，但也存在諸多弊端，如該法為逆向顯色，還原糖濃度控制稍有不當(dāng)或過(guò)量，即得不到任何結(jié)果。