今天，栢暉生物給大家整理了如何通過比色法測定植物中有效磷的含量，具體流程如下：
一、試劑
所有試劑除注明者外，均為分析純。
1.1 10%(w/v)的HClO4：取7.874ml 72% 的HClO4定容至100ml。
1.2 5%(w/v)的HClO4：取 39.3676ml 72%的HClO4定容至1L。
1.3 硫酸-鉬酸銨溶液（溶液A）
1）溶解1.0g鉬酸銨（NH4）6MO7O24·4H2O于約100ml水中；?
2）然后徐徐加入6.25ml濃H2SO4（98%）；?
3）充分混勻，冷卻后定容至250ml。??
1.4 10%（w/v）抗壞血酸（VC）溶液（溶液B）：溶解10g抗壞血酸于水中，溶解后定容至100ml，儲存于棕色瓶中，4℃保存。??
1.5 工作液：按體積比6:1混合溶液A和溶液B
注：工作液需要每天配置，現(xiàn)配現(xiàn)用，配好后放置2小時后再使用。
1.6 磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（60ppm?）:準(zhǔn)確稱取0.230g磷酸二氫銨（NH4H2PO4）于水中，并定容至100ml，即得600ppm的磷標(biāo)液。將600ppm的磷標(biāo)液用提取劑【1:9（10% HClO4：5% HClO4）】稀釋10倍，得60ppm的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。
二、主要儀器
萬分之一分析天平、紫外可見分光光度計、恒溫振蕩機(jī)或往返式振蕩機(jī)、酸度計?
三、試樣的制備
取新鮮樣本剪碎充分混勻后，裝入樣本瓶放在4℃?zhèn)溆谩?/p>
四、分析步驟
4.1 稱取0.5g鮮樣稱重m，用液氮研磨成粉末。待研缽溫度上升后，加入1ml 10%HClO4研磨混勻。?
4.2 在研缽中分兩次加入4.5mL的5%高氯酸，共計9ml。第一次加入4.5mL 5%高氯酸到研缽中后，將勻漿液轉(zhuǎn)移到新的10ml離心管中；第二次再加入4.5mL 5%高氯酸到研缽中后，盡量洗凈研缽中的樣品，再將液體繼續(xù)轉(zhuǎn)移到第一次的10ml離心管中。
4.3 在冰上放置30min，每隔5min上下顛倒混勻幾次。則樣品制備溶液為10ml(V=1ml+9ml=10ml=0.01L)? 于4℃，10000g離心10min，取5ml上清液至新的離心管中，用于有效磷的測定（鉬藍(lán)法）。 4.4 取1ml(V1)上清液，在上清液中加入2ml的工作液，則反應(yīng)液為3ml(V2=上清液+工作液)，反應(yīng)液于40℃溫育20min。?
4.5 反應(yīng)液在室溫冷卻后，觀察藍(lán)色深淺，對藍(lán)色過深的樣品可適當(dāng)稀釋，地上部一般要稀釋5倍。每個樣品吸取200ul到酶標(biāo)板中，于820nm可見光波下用酶標(biāo)儀測定吸收值。
4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將60ppm的磷標(biāo)液用提取劑稀釋，形成稀釋標(biāo)液。再與工作液反應(yīng)，生成如下系列標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液溶液。用提取劑與工作液的反應(yīng)液做空白。
提取劑-V提? 1ml 990ul 950ul 920ul?900ul 850ul?820ul?800ul
標(biāo)液-V標(biāo)? 0? 10ul? 50ul 80ul?100ul?150ul?180ul?200ul?
工作液-V工? 2ml? 2ml? 2ml? 2ml? 2ml? 2ml? 2ml? 2ml?
濃度-y ppm 0 0.2 1.0 1.8 2.0 3.0 3.6 4.0
于40℃溫育20min后于820nm可見光波下用酶標(biāo)儀測定吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
五、結(jié)果計算
植物有效磷含量（mg/g）=C×（V2/V1）×V/M×N
式中：
C--為從校準(zhǔn)曲線或回歸方程求得的測定液有效磷的質(zhì)量濃度,mg/L；
V--為提取液體積，ml；
M--為稱取試樣質(zhì)量，g；
V1--為上清液體積，ml；
V2--為反應(yīng)液總體積，ml；
N--為稀釋倍數(shù)。