今天，我們通過5個(gè)食品樣本的分析案例給大家分享一下如何通過高效液相色譜法對(duì)17種水解氨基酸進(jìn)行測(cè)定：
一、實(shí)驗(yàn)方法及原理
試樣經(jīng)酸水解得各種氨基酸后,經(jīng)高效液相色譜在線衍生檢測(cè)分析外標(biāo)法定量測(cè)定氨基酸酸的含量。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
2.1主要實(shí)驗(yàn)儀器? ???
HPLC（紫外檢測(cè)器，在線衍生）
離心機(jī)（12000rpm）
天平（0.01g，0.1mg）
超聲波清洗機(jī)（240w）
干式氮吹儀（100℃）
烘箱（105℃，115℃）
2.2 實(shí)驗(yàn)步驟
1、 水解：
準(zhǔn)確稱取一定量試樣（精確至0.0001g），使試樣中蛋白質(zhì)含量在10mg~20mg范圍內(nèi)。將稱量好的樣品置于水解管中。根據(jù)試樣的蛋白質(zhì)含量，在水解管內(nèi)加10mL~15mL6M鹽酸溶液。用氮?dú)庵脫Q管內(nèi)空氣后密封。
2、 水解管在115±5℃烘箱中水解22~24h后放至室溫，取出水解液，用0.22μm孔徑的濾膜過濾，取1ml續(xù)濾液至進(jìn)樣小瓶中，100℃氮吹干后用0.1M的HCL水溶液超聲溶解固體物質(zhì)，取溶液直接進(jìn)樣。（根據(jù)實(shí)際濃度可以用0.1M的HCL水溶液適當(dāng)稀釋，一般植物均可用1mL 0.1M HCL水溶液稀釋）
3、 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：
購買市售標(biāo)準(zhǔn)溶液（10pmol/μL、25pmol/μL、100pmol/μL、250pmol/μL、1000pmol/μL）。
2.3 色譜條件
參數(shù) | 值 |
色譜柱 | AdvanceBio AAA C18，4.6 × 100 mm, 2.7 μm |
流速 | 1.5 mL/min |
柱溫 | 40 °C |
流動(dòng)相 | A) 10 mmol/L 磷酸氫二鈉和 10 mM硼酸鈉溶液，用鹽酸將 pH 調(diào)節(jié)為 8.2 B) 甲醇:乙腈:水，45:45:10 (v:v:v) |
梯度程序 | 時(shí)間 (min) %B 0.0 2 0.35 2 15.7 100 15.8 2 18.0 2 |
檢測(cè)器 | 338 nm，帶寬 10 nm；參比 390 nm，帶寬 20 nm（一級(jí)氨基酸） 262 nm，帶寬 16 nm；參比 324 nm，帶寬 8 nm（二級(jí)氨基酸） |
進(jìn)樣程序 | ? 吸取 2.5 μL 硼酸鹽緩沖液（1號(hào)瓶） ? 吸取 1.0 μL 樣品 ? 在清洗口將3.5 μL 混合液混合 5 次 ? 等待 0.2 分鐘，然后吸取 0.5 μL OPA（2號(hào)瓶） ? 在清洗口將 4 μL 混合液混合 10 次 ? 吸取 0.4 μL FMOC（3號(hào)瓶） ? 在清洗口將 4.4 μL 混合液混合 10 次 ? 吸取 32 μL 稀釋劑（4號(hào)瓶，此步驟一般情況不使用） ? 在清洗口將 20 μL 混合液混合 8 次 ? 進(jìn)樣 ? 等待 0.1 分鐘 ? 閥切換至旁路 |
2.4 測(cè)定方法
依據(jù)保留時(shí)間一致性進(jìn)行定性識(shí)別，曲線外標(biāo)法定量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留進(jìn)間確定樣品中目標(biāo)物的色譜峰。以標(biāo)準(zhǔn)樣品目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)、濃度（單位：mg/L）為橫坐標(biāo)擬定曲線。再根據(jù)樣品中目標(biāo)物峰面積計(jì)算得出樣品中目標(biāo)物的濃度，從而計(jì)算樣品中目標(biāo)物的含量。
2.5 計(jì)算方法
