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土壤氨基糖實驗方法介紹

日期： 2024-07-15
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土壤氨基糖實驗流程如下：

一、實驗方法及原理

氨基糖在吡啶-甲醇溶液中,以 4-二甲氨基吡啶為催化劑的條件下與鹽酸羥胺和乙酸酐發(fā)生糖腈乙酰酯反應(yīng), 所得衍生物可利用氣相色譜測定。


二、實驗步驟


2.1主要實驗儀器???
GC（毛細管分流進樣口， FID檢測器）
鼓風烘箱（涵蓋105℃，可定時8h）
渦旋混合儀（2850rpm）
離心機（50mL，3650rpm）
冷凍干燥機
水浴鍋（45℃、80℃）
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（100mL，65℃）
離心機（5mL，8000rpm）

2.2 實驗步驟
1、水解：稱取約0.5~1.0g的土樣于水解管中，沿管壁加入5 mL 6 mol/L鹽酸，用氮氣置換水解管中空氣2min后密封。在烘箱中105℃放置8h水解。
2、凈化：
a)?除酸：待水解液冷卻至室溫后，加入200μgN-甲基氨基葡萄糖（1mg/mL水溶液，200μL）。渦旋儀震蕩30s混勻。取部分水解液于5mL離心管中，于8000rpm離心1min。取上清液2.5mL于50mL離心管中用氮氣于65℃吹干。用25mL純水溶解吹干后的殘渣。加0.4mol/LKOH和0.01mol/LHCL調(diào)節(jié)pH至6.6~6.8。
b)?除鹽：離心管以3000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移出上清液于100mL茄型瓶中，于65℃，25rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。再加入10mL無水甲醇分兩次溶解瓶中殘渣。后轉(zhuǎn)移至另一50mL離心管。氮吹至5mL以下，渦旋溶解管壁有機物后，以4000rpm離心5min，除鹽。再將上清液轉(zhuǎn)移到5mL衍生瓶中并加入100μg戊五醇（1mg/mL水溶液，100μL），于40℃氮氣吹干。
3、標準樣品制備：
同時準備3個標準樣品。另取衍生瓶中加入100μL混標（1mg/mL的氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖，0.5mg/mL胞壁酸），100μgN-甲基氨基葡萄糖（1mg/mL水溶液，100μL），100μg戊五醇（1mg/mL水溶液，100μL），輕輕搖勻后，與樣品衍生瓶一起吹干。
4、衍生：
a)?向吹干的樣品和標準樣品的衍生瓶中加入300μL衍生試劑（稱取鹽酸羥胺320mg，4-二甲基氨基吡啶400mg，用吡啶：甲醇=4:1（v:v）溶液溶解稀釋至10ml）后蓋緊。渦旋30s混勻。
b)?在80℃水浴35min，每5min震蕩一次。冷卻至室溫后加入1mL醋酐，渦旋30s混勻后，在80℃水浴25min，每5min震蕩一次。衍生管冷卻至室溫后加入1.5mL二氯甲烷，渦旋30s混勻。
5、衍生物凈化：
a)?往衍生管中加入1mL1mol/LHCL（取6 mol/L鹽酸約17mL，加水定容至100mL，搖勻）加蓋密封后渦旋30s。靜置分層后吸出上層無機相。
b)?改加1mL純水，重復(fù)上述步驟3次。最后一次盡量吸出無機相。
c)?剩余有機相于44℃下氮吹干。然后溶解到300μL稀釋劑（乙酸乙酯：正己烷=1:1（V:V）），然后轉(zhuǎn)移到帶內(nèi)插管進樣瓶中待測。


2.3色譜條件

土壤氨基糖實驗方法介紹


2.4測定方法

依據(jù)保留時間一致性進行定性識別，單濃度內(nèi)標法定量。根據(jù)標準樣品的保留進間確定樣品中目標物的色譜峰。以標準樣品中N-甲基氨基葡萄糖與目標物的峰面積、實際量比值得出目標物質(zhì)與內(nèi)標物之間的校正參數(shù)。再根據(jù)樣品中內(nèi)標物峰面積與目標物峰面積計算得出樣品中目標物的量，從而計算樣品中目標物的含量。

因為對照品跟樣品中加入了等量的戊五醇，因此根據(jù)對標準樣品和樣品中戊五醇的峰面積響應(yīng)值之比計算樣品中戊五醇的回收率來判斷樣品前處理過程的損失是否合理。



2.5計算方法
內(nèi)標校正參數(shù)計算：
土壤氨基糖實驗方法介紹
式中：
f——校正參數(shù)
A標——標準樣品中目標標準物質(zhì)峰面積；
m標——標準樣品中目標標準物質(zhì)的量，μg；


AN-甲基氨基葡萄糖——標準樣品中N-甲基氨基葡萄糖標準物質(zhì)峰面積；

mN-甲基氨基葡萄糖——標準樣品中N-甲基氨基葡萄糖標準物質(zhì)的量，μg。



樣品含量計算：
土壤氨基糖實驗方法介紹
式中：
w——樣品中目標物質(zhì)的含量，μg/g
f——校正參數(shù)
A樣——樣品中目標標準物質(zhì)峰面積
m樣——樣品稱樣量，g


AN-甲基氨基葡萄糖——標準樣品中N-甲基氨基葡萄糖標準物質(zhì)峰面積

mN-甲基氨基葡萄糖——標準樣品中N-甲基氨基葡萄糖標準物質(zhì)的量，μg



以戊五醇為目標物計算回收率：
土壤氨基糖實驗方法介紹
式中：
R——戊五醇回收率，%；
A樣——樣品中戊五醇峰面積
A|樣——標準樣品中戊五醇峰面積的平均值


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