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土壤中過氧化氫酶、過氧化物酶、硝酸鹽還原酶的檢測方法

日期: 2021-08-20
標簽:
過氧化氫酶--滴定法


01
實驗試劑

1.0.3%的過氧化氫溶液:將30%過氧化氫稀釋100倍。?

2.3N硫酸:吸取10mL鹽酸用蒸餾水稀釋至50ml。

3.0.1N高錳酸鉀溶液:1.58g高錳酸溶于100ml水。??

02
主要儀器

萬分之一分析天平、震蕩器、滴定管、試管夾

03
試樣的制備

取新鮮的實驗室待測樣品充分混勻后,按四分法縮減至100g,粉碎,然后全部通過10目孔徑篩,裝入樣品袋備用。

04
實驗方法

1.稱取2g試樣于50ml離心管中,加40ml蒸餾水,5ml0.3%過氧化氫溶液于震蕩機震蕩20min,取出后加入5ml3N硫酸,過濾后取25ml濾液與150ml三角瓶中,用0.1N高錳酸鉀滴定至淡粉紅色。

2.空白:不加土樣, 其他操作與樣品試驗相同。

05
計算方法

?過氧化氫酶活性=?(V-VS)C×51/V0×17/W

?V:為滴定空白所用的KMnO4體積;

?VS:為滴定樣品所用的KMnO4體積;

?C: 為KMnO4濃度;

?V0:為滴定體積25ml;

?W:為土重;


土壤中過氧化氫酶、過氧化物酶、硝酸鹽還原酶的檢測方法
過氧化物酶--比色法

01
試劑配制

? ? ?1.1%鄰苯三酚溶液:稱取1g鄰苯三酚,用蒸餾水融至100ml。
? ? ?2.0.5%H2O2溶液:取1ml30%H2O2稀釋至60ml。
? ? ?3.乙醚
? ? ?4.0.5mol/L HCL:吸4.17mL的濃鹽酸溶于100mL水。
? ? ?5.PH4.5檸檬酸磷酸緩沖溶液:0.1mol/L檸檬酸溶液: 19.2g C6H7O8溶至1L。0.2mol/L磷酸氫二鈉溶:53.63gNa2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H20溶至1L。取10.65ml檸檬酸和9.35mINa2HPO4混勻(用量較多可以乘以倍數(shù)配制),之后再用這兩種溶液調節(jié)PH即可。
? ? ?6.重鉻酸鉀標準溶液:0.75g重鉻酸鉀溶于1L0.5mol/LHCL溶液中。此時的溶液相當于50ml醚中含有5mg紫色沒食子素。
02
主要儀器

? ? 萬分之一分析天平、恒溫搖床、分光光度計

03
試樣的制備

? ? ?取新鮮的實驗室待測樣品充分混勻后,按四分法縮減至100g,粉碎,然后全部通過10目孔徑篩,裝入樣品袋備用。

04
分析步驟

? ? ?1.試樣溶液提取

稱取試樣1g,精準至0.001g,置于50ml離心管中,然后注入10m1%鄰苯三酚溶液和2ml0.5%H2O2溶液。震蕩后放置30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時。取出待測。

? ? ?2.空白溶液制備

除不加待測樣品外,應用的試劑和步驟操作同4.1。

? ? ?3.對照試樣溶液制備

除用10 mL蒸餾水代替基質(鄰苯三酚溶液)外,應用的試劑和步驟操作同4.1。

? ? ?4.標準曲線繪制

取重鉻酸鉀標準溶液0、1、2、4、6、8ml于比色管中用0.5mol的HCL稀釋至50ml。定容后,在分光光度計。上于430nm處比色測定。以吸光度為橫坐標,以濃度為縱坐標繪制標準曲線。?

? ? ?5.試樣測定

試樣濾液加4mlPH4.5的檸檬酸-磷酸緩沖溶液,再加35ml乙醚, 用力震蕩數(shù)次,萃取30min。最后,將含溶解的紫色沒食子素的著色乙醚相比色。比色波長為430nm。為了防止因乙醚引起的誤差,每比色一次用無水乙醇洗滌比色槽一次。?

05
結果計算
??
? ? ?過氧化氫酶活性,以2h后,1g土壤生成的紫色沒食子素毫克數(shù)表示。

過氧化物酶活性= (a樣品-a空白-a無基質)?×V/m

a為標曲上相對應的濃度。

V為顯色體積,即為乙醚的體積35ml。

m為樣品重量g。


土壤中過氧化氫酶、過氧化物酶、硝酸鹽還原酶的檢測方法
硝酸鹽還原酶--比色法

01
實驗試劑

1.1% KNO3?溶液;

2.1%葡萄糖;

3.CaCO3?

4.鋁鉀釩飽和液;

5.酚二磺酸:取3g重蒸酚與37g21.0ml)濃硫酸混合,在沸水浴上回流加熱6h;

6.10% NaOH

7.KNO3?標準液:精確稱取16.3052g重結晶KNO3?溶于蒸餾水中并稀釋至1L。使用前,將標準液再進行稀釋100倍(1ml0.1mgNO3---N)。

02
主要儀器
??

萬分之一分析天平,恒溫箱,水浴鍋,分光光度計

03
試樣的制備

取新鮮的實驗室待測樣品充分混勻后,按四分法縮減至?100g,粉碎,然后全部通過10目孔徑篩,裝入樣品袋備用。?

04
實驗過程
??
? ? ?1.試樣溶液提取,測定

1g土壤置于100ml減壓三角瓶中,加20mgCaCO3?1ml 1% KNO3?。仔細混合后,加1ml葡萄糖作為氫的供體,抽氣3min,稍搖蕩三角瓶,置于30℃恒溫培養(yǎng)24h。

培養(yǎng)結束后,加50ml水,1ml鋁鉀釩液。取20ml液移于磁皿上蒸干。加1 ml酚二磺酸處理10min。再加15ml蒸餾水,用10% NaOH調至微黃色,定容后于分光光度計上于400500處進行比色。

? ? ?2.對照試樣溶液制備

用滅菌土壤(180℃3h)代替試樣作對照,其余步驟同4.1。

? ???3.空白溶液制備

除不加待測樣品外,應用的試劑和步驟操作同4.1。

? ? ?4.標準曲線繪制

吸取50ml?KNO3?標準溶液,置于磁皿中,在沸水浴上蒸干,殘渣用2ml酚二磺酸處理10min。再加15ml蒸餾水,定容至500ml(1ml含0.01mgNO3---N))。吸取此溶液5-40ml于50ml容量瓶中,用10% NaOH調至微黃色,定容后于分光光度計上于400—500處進行比色,以光密度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。



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