1、范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了農(nóng)業(yè)生物質(zhì)原料中纖維素和半纖維素含量測(cè)定的高效液相色譜方法，以及木質(zhì)素含量測(cè)定的紫外分光光度方法和重量方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于農(nóng)作物秸稈纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的測(cè)定。
2、規(guī)范性引用文件
GB/T 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法
NY/T 3492?農(nóng)業(yè)生物質(zhì)原料?樣品制備
3、試劑和材料
除非另有說(shuō)明，所有試劑均為分析純的試劑，色譜用水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水，其他使用三級(jí)水。
3.1乙醇:95%.
3.2 72%硫酸溶液:量取665 mL硫酸(98%)，緩緩注入300 ml水中，冷卻，搖勻。
3.3 碳酸鈣。
3.4 D-纖維二糖、D(+)葡萄糖、D (+)木糖、D(+)半乳糖、L(+)阿拉伯糖、D(+)甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥95%。
4、儀器和設(shè)備
4.1 分析天平:感量0.1 mg。
4.2 索氏抽提器:250 mL。
4.3 電熱鼓風(fēng)干燥箱:溫度可控制在(45±3)℃和(105±3)℃。
4.4 恒溫水浴鍋：溫度可控制在(30±3)℃?。
4.5 高壓蒸汽滅菌器：溫度可控制在(121±3)℃?。
4.6 馬弗爐:可程序開(kāi)溫，溫度可控制在(575±25)℃?。
4.7 耐壓試管:螺紋具塞，耐壓≥60psi。
4.8 真空過(guò)濾器:配玻璃砂芯坩堝(G4)。
4.9 高效液相色譜儀:配示差折光檢測(cè)器。
4.10 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):可在 320 nm處測(cè)定吸光值。
4.11 ?微孔過(guò)速器:帶0.22μm水相微孔濾膜。
5、分析步驟：
按照NY/T 3492的規(guī)定執(zhí)行。
5.2.1水抽提
稱(chēng)取2g~10g試樣(精確至0.1 mg)于已稱(chēng)重的濾紙筒中，將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內(nèi),連接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入190 mL水，于電熱套上加熱，使水不斷回流抽提(4次/h~5次/h)，一般抽提6h~8h。抽提完成后，關(guān)閉加熱套，將索氏抽提器冷卻至室溫。
5.2.2乙醇抽提
將5.2.1水抽提后的抽提筒連接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入190 mL乙醇，于電熱套上加熱，使乙醇不斷回流抽提(6次/h~10次/h），一般抽提16h~24h。抽提完成后，關(guān)閉加熱套，將索氏抽提器冷卻至室溫。經(jīng)兩步抽提后的生物質(zhì)試樣(即不含抽提物試樣)在(45±3)℃干燥箱中干燥至恒重，稱(chēng)量試樣質(zhì)量精確至0.1 mg。
5.3.1坩堝恒重
將玻璃砂芯坩鍋(G4)置于馬弗爐中，在(575±25)℃下灼燒至恒重。將坩堝從馬弗爐中取出后放入干燥器冷卻，稱(chēng)量坩堝質(zhì)量精確至0.1 mg。
5.3.2濃酸水解
稱(chēng)取300.0mg(精確至0.1mg)不含抽提物試樣至耐壓試管，每個(gè)試樣做2次以上平行實(shí)驗(yàn)。向耐壓試管中加入3.00 mL 72%硫酸溶液后立即混合均勻，將耐壓試管放入(30±3)℃水浴中，5 min~10min攪拌一次。恒溫60 min后取出，向耐壓試管中加入84.00 mL水，擰緊蓋子混合均勻。
5.3.3糖的回收率
用于計(jì)算回收率的糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稱(chēng)為糖回收標(biāo)準(zhǔn)溶液，包括D(+)葡萄糖、D (+)木糖、D (+)半乳糖、L(+)阿拉伯糖、D(+)甘露糖。糖回收標(biāo)準(zhǔn)溶液的糖濃度應(yīng)該與檢測(cè)試樣的糖濃度接近。稱(chēng)量每種糖的質(zhì)量精確至0.1 mg，放入耐壓試管中，加入10.0 mL水，再加入348μL72%硫酸溶液,擰緊蓋子混勻。用微孔過(guò)濾器過(guò)濾,分裝于樣品瓶中，冷凍儲(chǔ)藏，使用時(shí)取出解凍并搖勻。
5.3.4稀酸水解
將裝有試樣和糖回收標(biāo)準(zhǔn)溶液的耐壓試管放入高壓蒸汽滅菌器中，121℃水解1 h，待水解產(chǎn)物冷卻至室溫后，通過(guò)玻璃砂芯坩堝(G4)過(guò)濾，用錐形瓶收集濾液約50 mL，轉(zhuǎn)移至具塞容器0℃~4℃儲(chǔ)藏，于24h內(nèi)進(jìn)行纖維素和半纖維素測(cè)定，6 h內(nèi)進(jìn)行酸溶木質(zhì)素的測(cè)定。
5.4.1酸溶木質(zhì)素
使用5.3.4酸水解溶液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在320 nm處測(cè)量液體試樣的吸光值。用水作紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)空白,用水稀釋試樣至吸光值為0.7~1.0，記錄稀釋倍數(shù)，記錄吸光值精確到0.001。
5.4.2酸不溶木質(zhì)素
5.4.2.1用大于50 mL的熱水沖洗100 mL具塞耐壓試管中殘留的酸不溶殘?jiān)?，使殘?jiān)勘Ａ粼诓Ａ靶聚釄?G4)中，并用真空過(guò)濾器抽干。在(105±3)℃烘干玻璃砂芯坩堝(G4)和酸不溶殘?jiān)梁阒?，記錄玻璃砂芯坩?G4)和酸不溶殘?jiān)|(zhì)量，精確到0.1mg。
5.4.2.2將玻璃砂芯坩堝(G4)及酸不溶殘?jiān)糜隈R弗爐中(575±25)℃灼燒至少3 h，直至所有有機(jī)物被灰化。升溫速率控制在10℃/min,以防止試樣燃燒以及強(qiáng)氣流引起的試樣機(jī)械損失?；一Y(jié)束后降溫至105℃，取出放入干燥器中冷印。稱(chēng)量坩堝和灰分質(zhì)量精確到0.1 mg。
5.4.3碳水化合物
5.4.3.1色譜條件
色譜柱:聚苯乙烯二乙烯苯樹(shù)脂鉛型糖分析柱，配備相應(yīng)除灰保護(hù)柱。
流動(dòng)相：水。
流速:0.6mL/min。
柱溫：80℃~85℃。
進(jìn)樣量：20μL。
檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度盡可能接近柱溫箱溫度。
5.4.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
參照表1中建議的濃度范圍準(zhǔn)備D-纖維二糖、D(+)葡萄糖、D(+)木糖、D (+)半乳糖、L(+)阿拉伯糖、D(+)甘露糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用四點(diǎn)校正法。分別吸取20μL標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀,在5.4.3.1色譜條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值(峰面積)，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
表1 糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的建議質(zhì)量濃度范圍
5.4.3.3 試樣溶液測(cè)定
取20 mL 5.3.4酸水解液體到50 mL錐形瓶中，緩慢加入碳酸鈣將水解液中和至pH5~6。待試樣沉淀后輕輕倒出上清液。將上清液用微孔過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜分析。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算試樣中的D(+)葡萄糖、D(+)木糖、D (+)半乳糖、(+)阿拉伯糖和D(+)甘露糖含量。
注:檢測(cè)試樣中纖維二糖的含量高于3 mg/mL說(shuō)明水解作用不完全。在纖維二糖之前有峰存在，表明試樣中糖發(fā)生了過(guò)度水解。
6、結(jié)果計(jì)算
試樣中的酸溶木質(zhì)素含量ASL，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)表示，按式(1)計(jì)算。
試樣中的酸不溶木質(zhì)素含量AIL，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)表示，按式(2)計(jì)算。
試樣中的總木質(zhì)素含量Lig，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)表示，按式(3)計(jì)算。
6.4.1糖回收率
D-纖維二糖、D(+)葡萄糖、D (+)木糖、D(+)半乳糖、L(+)阿拉伯糖、D(+)甘露糖的回收率Ri，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)表示，按式(4)計(jì)算。
6.4.2纖維素和半纖維素含量計(jì)算
6.4.2.1試樣中的葡萄糖、木聚糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖、甘露聚糖的含量Zi，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)表示，按式(5)計(jì)算。
6.4.2.2試樣中纖維素含量Cel，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)，按式(6)計(jì)算。
6.4.2.3試樣中半纖維素含量Hem，以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(%)表示，按式(7)計(jì)算。
注:考慮農(nóng)作物秸稈中組成半纖維素的阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖含量較低,秸稈中半纖維素含量也可以木聚糖含量表示，
測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留2位有效數(shù)字。
7、精密度
在重復(fù)性條件下獲得的2次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。
