超氧化物歧化酶（SOD）是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員，廣泛分布在微生物、植物和動物體內(nèi)。其是在上個世紀末才被發(fā)現(xiàn)，可以說是生物醫(yī)學(xué)研究史上的一項重大成果,于人類生命研究具有極其重要的意義。今天我們就給大家分享一下如何通過比色法測定植物酶活SOD。
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一、試劑
所有試劑除注明者外，均為分析純。
1.1 磷酸緩沖液：
A液：0.2M的KH2PO4溶液?分析純KH2PO4? 27.216克，用蒸餾水定容至1000毫升。?
B液：0.2M的K2HPO4溶液?分析純K2HPO4?3H2O?45.644克，用蒸餾水定容至1000毫升。
或?
A液：0.2M的NaH2PO4溶液?分析純NaH2PO4?2H2O? 31.21克，用蒸餾水定容至1000毫升。?
B液：0.2M的Na2HPO4溶液? 分析純Na2HPO4?12H2O?71.64克，用蒸餾水定容至1000毫升。
1.2 母液的配制：?
（1）0.5M?磷酸緩沖液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml；?
（2）130mM?Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met?用磷酸緩沖液（PH=7.8）定容至100ml；?
（3）750μM四氮唑藍（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸緩沖液（PH=7.8）定容至100ml(避光保存)；?
（4）100μM?EDTA-Na2：取0.0372g?EDTA-Na2用磷酸緩沖液（PH=7.8）定容至1000ml；?
（5）20μM?FD?(核黃素)：0.00753gFD用磷酸緩沖液（PH=7.8）定容至1000ml（現(xiàn)配現(xiàn)用）。?
1.3 SOD反應(yīng)液：?
磷酸緩沖液（PH=7.8）：Met：NBT：EDTA-Na2：核黃素（FD）：H2O的比例為15：3：3：3：3：2.5，按母液順序配制。?
二、主要儀器
萬分之一分析天平、紫外分光光度計、醫(yī)用離心機、研缽
三、試樣的制備
取新鮮樣本剪碎充分混勻后，裝入樣本瓶放入4℃冷藏備用。
四、分析步驟
4.1 酶液的制備：?
稱取鮮樣0.5g放入研缽中，加5毫升PH=7.8的磷酸緩沖液，冰浴研磨，勻漿倒入離心管中，冷凍離心20分鐘（10000×g），上清液（酶液）倒入試管中，置于0～4℃下保存待用。?
4.2 SOD的測定?
取型號相同的試管，吸取20ul的酶液，加入3ml反應(yīng)液，4000Lux照光（多用為環(huán)形日光燈的光照培養(yǎng)箱）30分鐘（盡量做到照光情況一致）
4.3 空白與對照的制備
同時取四支試管，三支做對照（CK），一支做空白（不加酶液，以緩沖液代替）；空白置暗處，對照（CK）與酶液同至于4000Lux條件下照光30分鐘，遮光保存，以空白調(diào)零，560nm比色。?
4.4 若光照后顏色過深，可適當(dāng)多取酶液進行測定
五、結(jié)果計算
SOD總活性（吸光度/g·FW）=（ACK—A）×V／（W×0.5×ACK）
式中：
ACK--為對照在560nm下測得的吸光度；
A--為試樣在?560nm下測得的吸光度；
V--為提取液體積，ml；
W--為稱取試樣鮮重的質(zhì)量，g；
0.5--為光照時間，h；
單位：NBT光還原50%為單位?
SOD比活性（酶單位/mg蛋白）=?SOD總活性/可溶性蛋白質(zhì)濃度