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土壤氨基糖實(shí)驗(yàn)方法介紹

日期： 2024-07-15
標(biāo)簽:

土壤氨基糖實(shí)驗(yàn)流程如下：

一、實(shí)驗(yàn)方法及原理

氨基糖在吡啶-甲醇溶液中,以 4-二甲氨基吡啶為催化劑的條件下與鹽酸羥胺和乙酸酐發(fā)生糖腈乙酰酯反應(yīng), 所得衍生物可利用氣相色譜測定。


二、實(shí)驗(yàn)步驟


2.1主要實(shí)驗(yàn)儀器???
GC（毛細(xì)管分流進(jìn)樣口， FID檢測器）
鼓風(fēng)烘箱（涵蓋105℃，可定時(shí)8h）
渦旋混合儀（2850rpm）
離心機(jī)（50mL，3650rpm）
冷凍干燥機(jī)
水浴鍋（45℃、80℃）
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（100mL，65℃）
離心機(jī)（5mL，8000rpm）

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟
1、水解：稱取約0.5~1.0g的土樣于水解管中，沿管壁加入5 mL 6 mol/L鹽酸，用氮?dú)庵脫Q水解管中空氣2min后密封。在烘箱中105℃放置8h水解。
2、凈化：
a)?除酸：待水解液冷卻至室溫后，加入200μgN-甲基氨基葡萄糖（1mg/mL水溶液，200μL）。渦旋儀震蕩30s混勻。取部分水解液于5mL離心管中，于8000rpm離心1min。取上清液2.5mL于50mL離心管中用氮?dú)庥?5℃吹干。用25mL純水溶解吹干后的殘?jiān)?。?.4mol/LKOH和0.01mol/LHCL調(diào)節(jié)pH至6.6~6.8。
b)?除鹽：離心管以3000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移出上清液于100mL茄型瓶中，于65℃，25rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。再加入10mL無水甲醇分兩次溶解瓶中殘?jiān)：筠D(zhuǎn)移至另一50mL離心管。氮吹至5mL以下，渦旋溶解管壁有機(jī)物后，以4000rpm離心5min，除鹽。再將上清液轉(zhuǎn)移到5mL衍生瓶中并加入100μg戊五醇（1mg/mL水溶液，100μL），于40℃氮?dú)獯蹈伞?/span>
3、標(biāo)準(zhǔn)樣品制備：
同時(shí)準(zhǔn)備3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品。另取衍生瓶中加入100μL混標(biāo)（1mg/mL的氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基甘露糖，0.5mg/mL胞壁酸），100μgN-甲基氨基葡萄糖（1mg/mL水溶液，100μL），100μg戊五醇（1mg/mL水溶液，100μL），輕輕搖勻后，與樣品衍生瓶一起吹干。
4、衍生：
a)?向吹干的樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的衍生瓶中加入300μL衍生試劑（稱取鹽酸羥胺320mg，4-二甲基氨基吡啶400mg，用吡啶：甲醇=4:1（v:v）溶液溶解稀釋至10ml）后蓋緊。渦旋30s混勻。
b)?在80℃水浴35min，每5min震蕩一次。冷卻至室溫后加入1mL醋酐，渦旋30s混勻后，在80℃水浴25min，每5min震蕩一次。衍生管冷卻至室溫后加入1.5mL二氯甲烷，渦旋30s混勻。
5、衍生物凈化：
a)?往衍生管中加入1mL1mol/LHCL（取6 mol/L鹽酸約17mL，加水定容至100mL，搖勻）加蓋密封后渦旋30s。靜置分層后吸出上層無機(jī)相。
b)?改加1mL純水，重復(fù)上述步驟3次。最后一次盡量吸出無機(jī)相。
c)?剩余有機(jī)相于44℃下氮吹干。然后溶解到300μL稀釋劑（乙酸乙酯：正己烷=1:1（V:V）），然后轉(zhuǎn)移到帶內(nèi)插管進(jìn)樣瓶中待測。


2.3色譜條件

土壤氨基糖實(shí)驗(yàn)方法介紹


2.4測定方法

依據(jù)保留時(shí)間一致性進(jìn)行定性識(shí)別，單濃度內(nèi)標(biāo)法定量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留進(jìn)間確定樣品中目標(biāo)物的色譜峰。以標(biāo)準(zhǔn)樣品中N-甲基氨基葡萄糖與目標(biāo)物的峰面積、實(shí)際量比值得出目標(biāo)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物之間的校正參數(shù)。再根據(jù)樣品中內(nèi)標(biāo)物峰面積與目標(biāo)物峰面積計(jì)算得出樣品中目標(biāo)物的量，從而計(jì)算樣品中目標(biāo)物的含量。

因?yàn)閷φ掌犯鷺悠分屑尤肓说攘康奈煳宕迹虼烁鶕?jù)對標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品中戊五醇的峰面積響應(yīng)值之比計(jì)算樣品中戊五醇的回收率來判斷樣品前處理過程的損失是否合理。



2.5計(jì)算方法
內(nèi)標(biāo)校正參數(shù)計(jì)算：
土壤氨基糖實(shí)驗(yàn)方法介紹
式中：
f——校正參數(shù)
A標(biāo)——標(biāo)準(zhǔn)樣品中目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積；
m標(biāo)——標(biāo)準(zhǔn)樣品中目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量，μg；


AN-甲基氨基葡萄糖——標(biāo)準(zhǔn)樣品中N-甲基氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積；

mN-甲基氨基葡萄糖——標(biāo)準(zhǔn)樣品中N-甲基氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量，μg。



樣品含量計(jì)算：
土壤氨基糖實(shí)驗(yàn)方法介紹
式中：
w——樣品中目標(biāo)物質(zhì)的含量，μg/g
f——校正參數(shù)
A樣——樣品中目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積
m樣——樣品稱樣量，g


AN-甲基氨基葡萄糖——標(biāo)準(zhǔn)樣品中N-甲基氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積

mN-甲基氨基葡萄糖——標(biāo)準(zhǔn)樣品中N-甲基氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量，μg



以戊五醇為目標(biāo)物計(jì)算回收率：
土壤氨基糖實(shí)驗(yàn)方法介紹
式中：
R——戊五醇回收率，%；
A樣——樣品中戊五醇峰面積
A|樣——標(biāo)準(zhǔn)樣品中戊五醇峰面積的平均值


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