1. 產(chǎn)品概要
重組克隆技術(shù)是目前一種最新型、快速、簡潔的克隆技術(shù)，PCR產(chǎn)物連接載體不受酶切位點限制。將載體在選擇克隆位點處進行線性化后，在插入片段 PCR 引物 5’端引入線性化克隆載體末端序列，使得插入片段 PCR 產(chǎn)物 5’和 3’ 最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應的完全一致的序列(15 bp～20 bp)。這種兩端帶有載體末端序列的 PCR 產(chǎn)物和線性化克隆載體按一定比例混合后，在Clone Mix 的催化作用下，僅需反應 50min 即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。克隆陽性率可達 95%以上。
產(chǎn)品優(yōu)點 :
—簡單、快速、高效
—穩(wěn)定性強，室溫可長期儲存
—適用于幾乎任何載體多克隆處任何位點進行定向克隆
—無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點
—可高效克隆 50 bp～10 kb 片段
—不依賴于連接酶及磷酸酶，克隆陽性率可達 95%以上
應用范圍：
—適用于大片段
—快速克隆
—高通量克隆
—無縫克隆
—DNA 定點突變
2.?產(chǎn)品組成
組分 | 50T | 100T |
Clone Mix | 200ul | 400ul |
?
3. 實驗方案
3.1 實驗流程
1）線性化載體制備
2）設(shè)計插入片段擴增引物
3）插入片段 PCR 擴增
4）重組反應
5）轉(zhuǎn)化、涂板
6）陽性克隆鑒定
3.2 線性化載體制備
選擇合適的克隆位點，并對克隆載體進行線性化?？寺≥d體線性化方式可以為限制性內(nèi)切酶酶切消化，也可以為反向 PCR 擴增。
3.3 插入片段擴增引物設(shè)計
引物設(shè)計是很重要的，在設(shè)計引物時同樣要遵循引物設(shè)計的基本原則，只不過上下游引物要加上 15~20bp 的載體同源序列。引物序列包括：5’-15~20bp 同源序列所需酶切位點序列（此處可不加）-特異性引物序列-3’。
3.4 插入片段 PCR 擴增
插入片段可用任意 PCR 酶(Taq 酶或高保真酶)擴增，無需考慮產(chǎn)物末端有無 A加尾(重組過程中將被去除，在最終載體中不會出現(xiàn))。我們推薦您使用高保真聚合酶進行擴增，以減少擴增突變的引入。PCR 結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳以檢驗擴增產(chǎn)量和特異性。
Clone Mix 重組反應體系兼容常規(guī) PCR 反應體系。因此，如擴增模板不是與克隆載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且 PCR 產(chǎn)物電泳條帶單一，擴增產(chǎn)物無需純化便可直接用于重組反應。若 PCR 擴增產(chǎn)物 DNA 純度較低，直接使用進行重組反應時，重組效率、克隆陽性率都將會有所降低。因此，在進行較大片段(>5kb)克隆實驗時，我們推薦您使用高質(zhì)量的試劑盒對
擴增產(chǎn)物進行膠回收純化以提高 DNA 純度。
3.5 進行重組反應
于室溫配制如下反應體系。如果不慎將液體粘在管壁，可通過短暫離心使其沉
入管底。
組分 |
|
Clone mix | 4ul |
插入片段 | 1-2ul |
線性化載體 | 2ul |
ddH2O | 補足至10ul |
無需冰上操作?；旌虾?，55℃水浴 20min，再 30℃水浴 30min，轉(zhuǎn)化或置于-20℃冰箱保存
3.6 反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板
取 5 μl 反應液，加入到 50 μl 感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。42℃熱激 90 s，冰水浴孵育 2 min。加入 900 μl SOC 或 LB 培養(yǎng)基，37℃搖菌 30 min，6000rpm 離心 5min，棄上清，取 100 μl 菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，于 37℃過夜培養(yǎng)。
3.7 陽性克隆鑒定
我們推薦的方法是菌落 PCR。用無菌的槍頭粘單個菌落挑至 20μl PCR 反應體系中。我們推薦您至少用一條通用測序引物進行菌落 PCR，這樣可以避免 PCR假陽性的產(chǎn)生。將 PCR 陽性菌落的剩余菌液接種至含有適當抗生素的 LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒做后續(xù)的鑒定。