注意:所有試劑除注明者外,均為分析純。
1.1 磷酸緩沖液:
A液:0.2M的KH2PO4溶液分析純KH2PO4?27.216克,用蒸餾水定容至1000毫升。
B液:0.2M的KH2PO4溶液分析純K2HPO4·3H2O?45.644克,用蒸餾水定容至1000毫升。
或
A液:0.2M的NaH2PO4溶液分析純NaH2PO4·2H2O 31.21克,用蒸餾水定容至1000毫升。
B液:0.2M的Na2HPO4溶液分析純Na2HPO4?12H2O?71.64克,用蒸餾水定容至1000毫升。
1.2 母液的配制:
0.5M 磷酸緩沖液(PH=7.8):A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;
1.3?MDA反應(yīng)液的配置:
0.6克TBA(硫代巴比妥酸),先用少量1MNaOH溶解,用10%TCA(三氯乙酸)定容至100ml。
萬分之一分析天平、紫外分光光度計(jì)、醫(yī)用離心機(jī)、研缽
取新鮮樣本剪碎充分混勻后,裝入樣本瓶備放入4℃冷藏用。
4.1酶液的制備:
稱取鮮樣0.5g放入研缽中,加5毫升PH=7.8的磷酸緩沖液,冰浴研磨,勻漿倒入離心管中,冷凍離心20分鐘(10000×g),上清液(酶液)倒入試管中,置于0~4℃下保存待用。
4.2?MDA的測定:
1ml酶液+2ml0.6%的TBA,封口沸水浴15分鐘,迅速冷卻后再離心,取上清液,在600、532、450nm 三個(gè)波長下比色。
五、 結(jié)果計(jì)算:
式中:
A600、A532、A450—為試樣在600、532、450nm下測得的吸光度
W—為稱取試樣鮮重質(zhì)量,g;
V—為提取液體積,ml。