Abstract:?Understanding the effects of changing climate and long-term human activities on soil organic carbon (SOC) and the?mediating roles of microorganisms is critical to maintain soil C stability in agricultural ecosystem. Here, we took samples?from a long-term soil transplantation experiment, in which large transects of Mollisol soil in a cold temperate region were?translocated to warm temperate and mid-subtropical regions to simulate different climate conditions, with a fertilization?treatment on top. This study aimed to understand fertilization effect on SOC and the role of soil microorganisms featured?after long-term community incubation in warm climates. After 12 years of soil transplantation, fertilization led to less?reduction of SOC, in which aromatic C increased and the consumption of O-alkyl C and carbonyl C decreased. Soil live?microbes were analyzed using propidium monoazide to remove DNAs from dead cells, and their network modulization?explained 60.4% of variations in soil labile C. Single-cell Raman spectroscopy combined with D2O isotope labeling?indicated a higher metabolic activity of live microbes to use easily degradable C after soil transplantation. Compared with?non-fertilization, there was a significant decrease in soil α- and β-glucosidase and delay on microbial growth with?fertilization in warmer climate. Moreover, fertilization significantly increased microbial necromass as indicated by amino?sugar content, and its contribution to soil resistant C reached 22.3%. This study evidentially highlights the substantial?contribution of soil microbial metabolism and necromass to refractory C of SOC with addition of nutrients in the long-term.

摘要：了解氣候變化和人類長期活動(dòng)對(duì)土壤有機(jī)碳（SOC）的影響以及微生物的調(diào)控作用是維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)土壤C穩(wěn)定的關(guān)鍵。本研究進(jìn)行了一個(gè)長期土壤移置實(shí)驗(yàn)即將寒溫帶的黑土遷移至暖溫帶和中亞熱帶地區(qū)以模擬不同的氣候條件，并在頂部進(jìn)行施肥處理。研究旨在了解在溫暖氣候條件下長期群落培養(yǎng)后，施肥對(duì)土壤有機(jī)碳的影響以及土壤微生物的作用。土壤移置12年后，施肥導(dǎo)致SOC減少，其表現(xiàn)為芳香C的增加，以及氧烷基C和羰基C的減少。用疊氮溴化丙錠去除死細(xì)胞中的DNAs后，對(duì)土壤中活的細(xì)菌群落進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其網(wǎng)絡(luò)模塊化解釋了60.4%的土壤易分解C變化。單細(xì)胞拉曼光譜結(jié)合D₂O同位素標(biāo)記表明土壤移置后活微生物對(duì)易降解碳的代謝活性較高。與不施肥相比，氣候變暖與施肥條件下，土壤α-和β-葡萄糖苷酶活性顯著降低，微生物生長延緩。此外，施肥顯著增加了土壤微生物殘?bào)w（necromass，以氨基糖含量為指標(biāo)），其對(duì)土壤頑固性碳的貢獻(xiàn)率達(dá)22.3%。本研究強(qiáng)調(diào)了土壤微生物代謝和殘?bào)w對(duì)土壤穩(wěn)定性有機(jī)碳固存的重要貢獻(xiàn)。

研究背景：

土壤SOC是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最大的C庫，其動(dòng)態(tài)變化直接影響全球C平衡。土壤C和氮（N）循環(huán)緊密耦合，并很大程度上受氣候變化和人類活動(dòng)的影響。長期施肥增加了土壤養(yǎng)分有效性，并顯著地影響土壤C動(dòng)態(tài)。盡管施肥具有增加土壤C儲(chǔ)量的潛力，但就長期而言，土壤C穩(wěn)定性取決于未來氣候變化。土壤有機(jī)碳對(duì)長期施肥的響應(yīng)程度和方向受溫度和降水的影響。根據(jù)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的長期野外觀測(cè)和模型模擬，發(fā)現(xiàn)土壤養(yǎng)分和氣候因子的交互影響決定了32%土壤有機(jī)碳的變異，并與微生物代謝、酶活性和殘?bào)w微生物周轉(zhuǎn)密切相關(guān)。

土壤微生物不僅能分解土壤有機(jī)質(zhì)，還能代謝植物殘?bào)w或通過合成代謝形成殘?bào)w來穩(wěn)定土壤C。微生物殘?bào)w通常與土壤礦物質(zhì)表面緊密結(jié)合而形成相對(duì)穩(wěn)定的C。土壤微生物碳泵理論表明，微生物通過體外修飾（ex vivo?modification）和體內(nèi)周轉(zhuǎn)（in vivo?turnover）來調(diào)節(jié)土壤碳的積累。這意味著作為難降解C源，微生物代謝產(chǎn)物或殘?bào)w對(duì)有機(jī)碳的貢獻(xiàn)很大，而養(yǎng)分或易降解C的添加也可以長期增加土壤有機(jī)質(zhì)。這一過程受到多因素環(huán)境變化的強(qiáng)烈影響。因此，需要進(jìn)一步研究不同氣候條件和長期施肥下微生物生理代謝和殘?bào)w對(duì)土壤碳的貢獻(xiàn)，以更好地理解農(nóng)業(yè)土壤有機(jī)碳的積累和穩(wěn)定性。

主要結(jié)果：

1.?施肥對(duì)不同氣候條件下SOC數(shù)量與質(zhì)量的影響

土壤移置12年后，在較溫暖的氣候條件下，SOC的損失顯著減少（TransS2處理）（Fig.?1a）。施肥顯著提高了TransS2處理下土壤頑抗性碳組分（RC）中的芳香C含量，其芳香度指數(shù)是Trans S2處理的2.7倍?（Fig. 1a, b）,表明了在溫暖的氣候條件下，施肥促進(jìn)了腐殖化過程。對(duì)于土壤活性C組分（LC）而言，氣候變暖條件下未施肥土壤中氧烷基C和羰基C降低，而施肥顯著減緩了LC的損失。TransS2處理土壤在施肥后烷基/氧烷基C比率的降低（Fig. 1b）表明了施氮對(duì)易分解C的消耗具有潛在抑制作用。

圖1?土壤移置12年后，不同氣候條件下施肥對(duì)土壤有機(jī)碳及其分子群的影響。a代表在不同氣候條件下（TransS1表示寒溫帶土壤移至暖溫帶；TransS2表示寒溫帶土壤移至亞熱帶）施肥對(duì)SOC以及其分子類群（烷基C，O-烷基C，縮醛C，芳香C和羰基C）的影響；b中A/O-A%（%）=烷基C峰面積（0-45 ppm）/O-烷基C峰面積（45-90 ppm）*100%，芳香性程度（%）=芳香C峰面積（110-160 ppm）/總峰面積（0-160 ppm）*100%。圖中*，**，***分別代表p < 0.05，p < 0.01和***p < 0.001。

2.?活細(xì)菌群落和總微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化

施肥顯著改變了不同氣候條件下細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)（Fig. 2a）,?增加活細(xì)菌α-多樣性，降低總細(xì)菌α-多樣性。與土壤地球化學(xué)屬性的影響相比，施肥和氣候因子（MAT和MAP）是改變活微生物群落結(jié)構(gòu)和總微生物群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素（Table?1）。

Fig.?2?活微生物和總微生物的群落組成及模塊化分析。a代表活細(xì)菌群落和總細(xì)菌群落組成的比較，圖中僅顯示了相對(duì)豐度排名前十的細(xì)菌門，其他細(xì)菌門均表示為“其他門”；b基于隨機(jī)森林模型，在活微生物和總微生物中排名前八的網(wǎng)絡(luò)模塊對(duì)土壤不穩(wěn)定碳（LC）成分變化的貢獻(xiàn)。

Table 1?微生物群落組成與土壤理化性質(zhì)（pH，SOC，TN，TP，NO3--N, NH4+-N），氣候條件變化和施肥之間Mantel及偏Mantel檢驗(yàn)。

? ? ? ? ?3.?活微生物/總微生物比與土壤易分解碳和頑固性碳之間的關(guān)系

隨機(jī)森林模型中有5個(gè)活微生物模塊和3個(gè)總微生物模塊對(duì)LC變化有顯著貢獻(xiàn)，解釋率分別為60.4%和44.9%（Fig.?2b）?？偽⑸飳?duì)RC的貢獻(xiàn)率（78.81%）高于活微生物(70.69%)?（Fig.?2b）。

4.?活微生物對(duì)碳組分貢獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)分析

通過Raman-D₂O法研究了活細(xì)菌的代謝活性，確定其在土壤移植后的降解能力（Fig.?3)。采用不同的基質(zhì)（淀粉和纖維素）以及D₂O培養(yǎng)細(xì)菌，其培養(yǎng)物在2040~2300 cm^-1范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的C -D拉曼譜帶。以淀粉為C源的情形下，?TransS1和TransS2的C-D/（C-D + C-H）比值顯著高于原位處理，而以纖維素為C源的情形下則趨勢(shì)相反。

Fig. 3?在施肥土壤中，以D2O同位素標(biāo)記同時(shí)結(jié)合單細(xì)胞Raman光譜技術(shù)探究不同碳源培養(yǎng)條件下土壤微生物的代謝活性。a?左側(cè)代表拉曼光譜，右側(cè)代表?C-D比率（C-D/（C-D+C-H））以及在50% D2O的無機(jī)鹽+淀粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后土壤細(xì)菌的拉曼mapping圖；b代表拉曼光譜，C-D比率以及在無機(jī)鹽+纖維素培養(yǎng)基中培養(yǎng)的土壤細(xì)菌的拉曼mapping圖；**和***分別代表p < 0.01和p < 0.001。

施肥顯著降低了TransS2中土壤α-和β-葡萄糖苷酶活性（Fig. 4a）。通過接種土壤懸浮液測(cè)試活體微生物對(duì)不同C源（淀粉和纖維素）分解能力的實(shí)驗(yàn)顯示施肥顯著降低了淀粉和纖維素分解所產(chǎn)生的CO₂（Fig.?4b），這表明施肥減少了TransS2土壤不穩(wěn)定碳和穩(wěn)定碳的損失。此外，分別繪制了活細(xì)菌在淀粉和纖維素中的生長曲線（Fig. 4c）。在較溫暖的氣候條件下，施肥土壤中細(xì)菌的生長活性低于未施肥土壤。特別是在以淀粉為碳源的情況下，施肥土壤中的細(xì)菌加速進(jìn)入穩(wěn)定期，而未施肥土壤中的細(xì)菌持續(xù)生長。

Fig.?4?不同氣候條件下施肥對(duì)不同碳源的土壤微生物代謝能力和生長的影響。a代表土壤酶活性（α-和β-葡萄糖苷酶）；b代表微生物降解淀粉和纖維素能力的微環(huán)境實(shí)驗(yàn)；c代表以淀粉和纖維素為C源培養(yǎng)條件下活的土壤微生物的生長曲線（n=9）。

? ? ? ? ?5.?基于氨基糖分析探究微生物殘?bào)w對(duì)SOC?的貢獻(xiàn)

在TransS2處理下，施肥顯著增加微生物殘?bào)w含量（Fig.?5a）。土壤移置12年后，微生物死生物質(zhì)的積累增加。采用偏RDA方法估算了土壤中活體微生物和死微生物以及土壤地球化學(xué)屬性對(duì)LC和RC組分的貢獻(xiàn)（Fig. 5b）：活細(xì)菌對(duì)LC組分的貢獻(xiàn)率為30.9%，遠(yuǎn)高于死微生物對(duì)LC組分的貢獻(xiàn)率（1.1%）。死亡微生物對(duì)RC組分的貢獻(xiàn)率為22.3%，高于活微生物（6.4%），表明了微生物殘?bào)w可能是土壤RC的主要貢獻(xiàn)者。

基于微生物?C泵理論，微生物代謝產(chǎn)物或殘?bào)w可以對(duì)RC-SOC有很大的貢獻(xiàn)，這強(qiáng)調(diào)微生物在碳吸存過程中的調(diào)節(jié)作用。本研究構(gòu)建了一個(gè)概念框架，以揭示在氮缺乏和充足的情況下，微生物生理代謝和殘?bào)w調(diào)控SOC吸存的潛在作用機(jī)制（圖6）。在溫暖氣候條件下，施肥可通過促進(jìn)微生物殘?bào)w的積累來補(bǔ)充土壤中的頑固性碳（芳香族C），同時(shí)降低活微生物對(duì)不穩(wěn)定的C組分的消耗來增加土壤C吸存。

Fig. 5?微生物死生物質(zhì)對(duì)土壤SOC的貢獻(xiàn)。a代表作為微生物殘?bào)w生物標(biāo)志物的土壤氨基糖含量，包括來自死真菌的氨基葡萄糖和來自死細(xì)菌的氨基半乳糖和胞壁酸，大寫字母表示不同氣候條件下施肥效應(yīng)具有顯著差異，小寫字母表示原位與移栽之間具有顯著差異；b代表土壤地球化學(xué)性質(zhì)、活細(xì)菌生物量和細(xì)菌氨基糖含量對(duì)土壤LC和RC影響的偏冗余分析（pRDA）。

Fig. 6不同氣候條件下施肥與非施肥土壤微生物對(duì)有機(jī)碳分子群的潛在調(diào)控機(jī)制示意圖。上圖中土壤顏色梯度反映了LC和RC分量的變化，高度代表了SOC的含量。左下圖表示了不同氣候條件下氮素限制或充足對(duì)微生物SOC代謝的影響機(jī)制。在不施肥的情況下，由于氮素的限制，植物和微生物可能會(huì)發(fā)出更強(qiáng)的氮饑餓信號(hào)，微生物產(chǎn)生更多的胞外酶分解有機(jī)碳以獲得氮源。此外，氮素缺乏減少了植物根系分泌物(易于降解的碳源)的輸入，增溫加速了土壤中不穩(wěn)定碳的消耗，進(jìn)一步刺激了土壤中微生物呼吸對(duì)穩(wěn)定碳的利用，導(dǎo)致土壤有機(jī)碳的減少。在施肥情況下，土壤微生物殘?bào)w的增加補(bǔ)充了土壤不穩(wěn)定碳，低氮饑餓信號(hào)降低了微生物對(duì)土壤穩(wěn)定碳的消耗。