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2022
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今天，我們通過5個食品樣本的分析案例給大家分享一下如何通過高效液相色譜法對17種水解氨基酸進(jìn)行測定：一、實驗方法及原理試樣經(jīng)酸水解得各種氨基酸后,經(jīng)高效液相色譜在線衍生檢測分析外標(biāo)法定量測定氨基酸酸的含量。二、實驗步驟2.1主要實驗儀器? ???HPLC（紫外檢測器，在線衍生）離心機(jī)（12000rpm）天平（0.01g，0.1mg）超聲波清洗機(jī)（240w）干式氮吹儀（100℃）烘箱（105℃，115℃）2.2 實驗步驟1、 水解：準(zhǔn)確稱取一定量試樣（精確至0.0001g），使試樣中蛋白質(zhì)含量在10mg~20mg范圍內(nèi)。將稱量好的樣品置于水解管中。根據(jù)試樣的蛋白質(zhì)含量，在水解管內(nèi)加10mL~15mL6M鹽酸溶液。用氮氣置換管內(nèi)空氣后密封。2、 水解管在115±5℃烘箱中水解22~24h后放至室溫，取出水解液，用0.22μm孔徑的濾膜過濾，取1ml續(xù)濾液至進(jìn)樣小瓶中，100℃氮吹干后用0.1M的HCL水溶液超聲溶解固體物質(zhì)，取溶液直接進(jìn)樣。（根據(jù)實際濃度可以用0.1M的HCL水溶液適當(dāng)稀釋，一般植物均可用1mL 0.1M HCL水溶液稀釋）3、 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：購買市售標(biāo)準(zhǔn)溶液（10pmol/μL、25pmol/μL、100pmol/μL、250pmol/μL、1000pmol/μL）。2.3 色譜條件參數(shù)值色譜柱AdvanceBio AAA C18，4.6 × 100 mm, 2.7 µm流速1.5 mL/min柱溫40 °C流動相A) 10 mmol/L 磷酸氫二鈉和 10 mM硼酸鈉溶液，用鹽酸將 pH 調(diào)節(jié)為 8.2B) 甲醇:乙腈:水，45:45:10 (v:v:v)梯度程序時間 (min) %B0.0 20.35 215.7 10015.8 218.0 2檢測器338 nm，帶寬 10 nm；參比 390 nm，帶寬 20 nm（一級氨基酸）262 nm，帶寬 16 nm；參比 324 nm，帶寬 8 nm（二級氨基酸）進(jìn)樣程序? 吸取 2.5 μL 硼酸鹽緩沖液（1號瓶）? 吸取 1.0 μL 樣品? 在清洗口將3.5 μL 混合液混合 5 次? 等待 0.2 分鐘，然后吸取 0.5 μL OPA（2號瓶）? 在清洗口將 4 μL 混合液混合 10 次? 吸取 0.4 μL FMOC（3號瓶）? 在清洗口將 4.4 μL 混合液混合 10 次? 吸取 32 μL 稀釋劑（4號瓶，此步驟一般情況不使用）? 在清洗口將 20 μL 混合液混合 8 次? 進(jìn)樣? 等待 0.1 分鐘? 閥切換至旁路2.4 測定方法依據(jù)保留...